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Obtención, por primera vez, de células madre humanas mediante transferencia nuclear

El día 15 de mayo de 2013 se publicó on-line en la revista Cell un artículo que, a buen seguro, será citado en numerosas ocasiones en los próximos meses y  años. El artículo, que tiene como fecha de publicación oficial el 6 de Junio de 2013, corresponde a un trabajo realizado en la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón, que ha sido dirigido por Shoukhrat Mitalipov- El trabajo ha conseguido la obtención, por primera vez, de células madre embrionarias humanas, genéticamente idénticas a las células de la piel que se han utilizado como donantes de información genética, tras la realización de un proceso de transferencia nuclear.

El procedimiento que el equipo ha utilizado para conseguir esas células madre embrionarias es, en esencia, similar al procedimiento de transferencia de núcleo que se aplica en la clonación reproductiva que se aplica a mamíferos no humanos: la técnica es muy similar al que se utilizó para crear a Dolly, por ejemplo. Sin embargo, a diferencia del caso de Dolly, como no se pretende obtener un individuo sino únicamente conseguir células madre, el desarrollo del embrión resultante del proceso de transferencia nuclear se ha detenido en una etapa muy inicial, cuando el embrión tiene, más o menos, un centenar de células indiferenciadas.

El trabajo que ahora se ha publicado es de una trascendencia espectacular: uno de los más ambiciosos objetivos en el ámbito de la investigación celular y de la clínica es desarrollar algún procedimiento que permita obtener células genéticamente compatibles con las de un paciente, de forma que puedan ser introducidas en ese paciente, a modo de terapia, y mantener la función de las células dañadas sustituidas. Para que esto sea posible, se ensaya en la posibilidad de obtener células madre, que sean genéticamente idénticas a las de un paciente cualquiera, de forma que esas células pluripotenciales (capaces de formar nuevos tipos de células) puedan ser diferenciadas en el laboratorio hacia el tipo celular requerido y posteriormente puedan ser introducidas en ese paciente.

Dos son los mecanismos principales en los que se confía para obtener células madre humanas:

1.- Partiendo de células adultas (diferenciadas), des-diferenciarlas y conseguir que alcancen un estado de pluri-potencialidad; a estas células se les denominann células madre pluripotenciales inducidas (o iPS)

2.- Partiendo de células adultas, generar un embrión y utilizar como células madre las células embrionarias, que biológicamente ya son pluripotenciales; a estas células se les denomina embryonic stem cells (o ESCs)

En ambos casos se requiere conseguir células madre genéticamente compatibles con las células y con el sistema inmune del paciente, así que se parte de células del propio paciente. Las células madre obtenidas serían posteriormente diferenciadas hacia tipos celulares como cardiomiocitos, hepatocitos, neuronas, etc.

Uno de los investigadores más reconocidos en la primera de las opciones es Yamanaka, merecedor del premio Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 2012, junto a John Gurdon. Yamanaka ha descrito un procedimiento mediante el que, introduciendo en las células adultas la secuencia de 4 genes determinados (los genes Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4), se consigue inducir la  des-diferenciación de las células adultas y obtener células madre iPS. El segundo de los mecanismos propuestos no había podido ser aplicado a humanos hasta ahora y es el que justamente ha desarrollado exitosamente el grupo de Mitalipov; en el están depositadas muchas esperanzas porque no implica la modificación genética de las células y, por tanto, se supone que su aplicación al ámbito clínico será más seguro y controlable.

El éxito conseguido por el grupo de Mitalipov se cree que se debe, entre otras cuestiones, a que han modificado prácticamente todas las etapas del procedimiento de transferencia nuclear que se venía aplicando en otras especies de mamíferos. Los cambios que han propuesto los habían depurado en ensayos que habían desarrollado en primates no humanos durante los últimos 8 años.

Básicamente el procedimiento ha consistido en:

  1. Obtener oocitos “de calidad” a partir de mujeres voluntarias sanas. Para ello, han modificado los protocolos de estimulación ovárica que venían aplicándose en humanos, de acuerdo con el protocolo que resultó más exitoso de los que ensayaron en primates no humanos. No está claro qué significa “de calidad”, pero el equipo de investigadores encuentra que existe una correlación inversa entre el número de oocitos obtenidos en un ciclo y la eficiencia en la obtención final de células madre, siendo más eficaz partir de ciclos en los que se han obtenido menos de 6 oocitos que en los que se obtienen del orden de 15 oocitos.
  2. Los oocitos (MII) obtenidos se mantienen en una solución de cafeína (un inhibidor de fosfatasas), lo cual evita su activación prematura (esto también es novedoso).
  3. Bajo microscopio de luz polarizada, y todavía con los oocitos en un medio con cafeína, se eliminan las fibras del huso de oocito MII mediante succión y se obtienen oocitos enuclados o citoplastos.
  4. Previamente se obtienen células adultas (en el trabajo utilizaron células dermales de humanos) que se llevan en el laboratorio a un estadío G0/G1. Estas células de la piel se utilizan como donadoras de núcleo. Durante un tiempo se mantienen en un medio de cultivo con partículas del virus Sendai inactivado; esta modificación del protocolo parece clave para que la fusión posterior sea eficaz.
  5. Posteriormente, se fusionan los núcleos de los fibroblastos dermales con los oocitos enuclados, al microscopio de luz polarizada y en presencia de cafeína.
  6. Tras la transferencia nuclear de los fibroblastos, los oocitos (ahora sin cafeína) se activan mediante electroporación y mediante la presencia de determinados compuestos químicos a determinadas concentraciones. También en la elección de los productos químicos y de sus concentraciones, el grupo de investigadores ha introducido modificaciones.

Puede visionarse un vídeo en el que se aprecia el proceso en este link.

La mayoría de los embriones obtenidos mediante esta técnica alcanzaron la fase de 8 células (32 de los 52 ensayados), pero unos pocos, por primera vez en la historia,  llegaron a la fase de mórula compacta (7 de 52) y de blastocisto (6 de 52), células a las que denominan NT-ESC (denominadas así por tratarse de células madre embrionarias, obtenidas mediante transferencia de núcleo). Las células que llegaron a blastocisto, fueron cultivadas y posteriormente analizadas.

Los investigadores han observado que estas células presentan características genéticas idénticas a los fiobroblastos embrionarios utilizados como células donadoras de núcleo y que presentan características equivalentes a las que se esperarían en células troncales o células madre. Así, cuando las inyectaron en ratones inmudeprimidos, produjeron tumores de diferentes tipos; además, los ensayos de diferenciación in vitro demostraron una formación eficiente de cuerpos embrioides en los cultivos en suspensión, que llegaban a formar cardiomiocitos que latían espontáneamente. En este link puede verse un vídeo en el que se observan los cardiomiocitos obtenidos, latiendo en la placa de cultivo.

Los análisis de los patrones de expresión génica de estas células NT-ESC mostraron que expresaban genes típicos de células madre (OCT-4, NANOG, SOX2, SSEA-4, TRA-1-81) y que presentaban una correlación transcripcional del 99% con cada tipo celular. De entre los genes que se expresan con mayor incidencia, destacan 50 genes (los que presentaban los incrementos más elevados en los niveles de expresión),  que corresponden a genes implicados en la pluripotencialidad.

Un trabajo impresionante el que ha realizado el equipo de Mitalipov, al que habrá que seguirle la pista y al que responderá la comunidad científica confirmando (o no) los resultados obtenidos y completando el conocimiento y el seguimiento a las células madre obtenidas  mediante este sistema.

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