Antropogenética

Práctica L3. Electroforesis.
Mediante la electroforesis en gel de agarosa se obtiene una resolución menor que con los geles de poliacrilamida, pero en muchos casos, cuando los tamaños de las bandas son notablemente diferentes, es suficiente. Es el caso del marcador indel que vamos a analizar, Map Tau.
Se realizará una electroforesis submarina, de modo que el gel se encuentre completamente sumergido en el tampón.

Preparación del gel.

Las muestras se desplazarán en un gel de agarosa al 1,5%.

1. Se pesan 1,12 g. de agarosa.
2. Se disuelven en 75 ml. de medio TBE (0,5X). Para ello se utiliza un microondas, ya que se disuelve con dificultad.
3. La disolución se deja enfriar unos 6 minutos.
4. Se centrifuga 5 segundos el colorante (Midori Green).
5. Se añaden 4 µl de Midori Green, para teñir las moléculas de ADN y poder verlas mediante iluminación ultravioleta.
6. Se prepara el soporte del gel con los peines en el contenedor, ajustando la tuerca para evitar la pérdida de agarosa.
7. Se vierte la agarosa en el soporte.

Preparación de la cubeta y las muestras.

1. Después de 20 minutos se habrá polimerizado el gel. Entonces se quitan los peines y se separa el soporte con el gel de su contenedor aflojando la tuerca.
2. Se deposita el gel con su soporte en la cubeta de electroforesis.
3. Se cubre por completo con medio TBE.

Electroforesis del gel.

1. Se añaden 2 µl de tampón de carga a las muestras de ADN amplificado.
2. Se cargan las muestras, pipeteando 10 µl de cada tubo de ADN amplificado en un pocillo, reservando el pocillo central para el marcador de tamaño del ADN
5 . Se coloca la tapa de la cubeta y se conectan los electrodos a la fuente de alimentación.
6. Las condiciones de elctroforesis son: 115 Voltios, 20 minutos.


Tnción, visualización y documentación.

1. Se para la fuente de alimentación.
2. Se desconecta la cubeta de la fuente.
3. Se levanta la tapa y se extrae el soporte con el gel.
4. Se deposita el gel en el transiluminador. Para su uso es preciso utilizar protección contra la luz ultravioleta.
5. Se fotografía el gel.

Anexo: El autoclave

Un autoclave es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio.
Si bien una parte importante del material fungible que se utiliza en el laboratorio es desechable, a menudo no viene esterilizado, de modo que debe pasar por el autclave.
Además, una parte del material de vidrio debe ser esterilizada después de cada uso.
Por lo general, la esterilización se obtiene por la obtención de vapor de agua a más de 120º, lo que se consigue mediante altas presiones, por lo que el equipo debe soportar elevadas presiones y temperaturas. Por esta razón, asimismo, aunque poseen notables medidas de seguridad, es preciso manipularlos con precaución, siguiendo las indicaciones para su uso.
Un accesorio importante es la cinta adhesiva especial para autoclaves, que no sólo sirve para precintar los envases, sino también para indicar si ha sido ya esterilizado el material y evitar confusiones. Esta cinta es blanca antes de su uso y muestra unas lineas negras después.
Un ciclo de esterilización comprende los siguientes pasos:
1. Obtención de vacío y precalentamiento.
2. Calentamiento.
3. Esterilización.
4. Evacuación del aire.
5. Secado.

Uso del equipo en un programa básico para plástico:
1. Asegurarse de que hay suficiente agua en el depósito. Debe ser agua ultrapura. Si no hay un nivel suficiente, al encender aparecerá el mensaje "IN".
2. Encender el equipo. Aparece el mensaje "Do". Comienza el precalentamiento.
3. Abrir la puerta. Colocar el material en las bandejas.
4. Cerrar la puerta. Si no está bien cerrada, aparece el mensaje de error "LD". Si está bien cerrada, aparece "Ld". Elegir el programa "PLASTIC".
5. Pulsar "Start". Durante la fase de calentamiento aparece el mensaje "HE". Durante las fases de esterilización y secado aparecerá "PL" o "TIME". Cuando termine de evacuar el aire aparecerá "0" y sonará un pitido.
6. Abrir el autoclave girando el pomo. Es preciso hacerlo con precaución, porque puede quedar vapor.


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