Doctoral theses defended

La enfermedad de Lyme es causada por la transmisión de la bacteria llamada Borrelia burgdorferi. Esta tesis tiene como objetivo el estudio de la respuesta inmune de los macrófagos a B. burgdorferi, centrándonos en los elementos involucrados en su actividad fagocítica y la posterior respuesta inflamatoria mediada por estas células, a fin de comprender más profundamente la interacción de este tipo de células y la bacteria. Mediante enfoques analíticos de gran escala, como la transcriptómica y la proteómica, hemos estudiado en macrófagos murinos y humanos, las rutas de señalización implicadas en la fagocitosis de este patógeno, y hemos descrito un conjunto de receptores de membranas responsables de su ingestión y eliminación. Nuestro estudio ha permitido el descubrimiento y descripción de los receptores CD180 y CD64 como elementos moduladores y mediadores de la respuesta inmune a B. burgdorferi, así como del consiguiente proceso inflamatorio. También hemos esclarecido la importancia y el comportamiento de diferentes factores de señalización, como SHIP1, FcR¿, Syk y MyD88, revelando la existencia de una compleja conexión entre las familias de los receptores que intervienen en el proceso de fagocitosis de este patógeno. Este conocimiento conducirá a una mejor comprensión del rol de los macrófagos en respuesta a B. burgdorferi, arrojando luz sobre los síntomas inflamatorios observados durante la borreolisis de Lyme y revelando nuevas dianas terapéuticas para un tratamiento más efectivo de la enfermedad.

La osteopontina es una proteína multifuncional que se expresa en numerosos tipos celulares y tejidos. Está implicada en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. La OPN se ha asociado a diferentes trastornos hepáticos, de hecho, su expresión se encuentra incrementada en diferentes etapas de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA). Además, juega un papel regulado el metabolismo lipídico hepático. Por lo tanto, en base a la evidencia de que la OPN está relacionado con trastornos hepáticos, cuya prevalencia aumenta con la edad; y que OPN desempeña un papel en el metabolismo de lípidos hepáticos, que se encuentra desregulado en el envejecimiento, proponemos que OPN podría tener un papel en la susceptibilidad del hígado a la progresión del EHGNA asociada al envejecimiento. Para este estudio se empleó una cohorte de pacientes con hígado sano y otra con EHGNA, además emplearon animales control y deficientes en OPN (OPN-KO) de 3, 10 y 20 meses de edad, así como líneas celulares hepáticas para estudios in-vitro. Los resultados mostraron que la OPN está implicada en el envejecimiento del hígado y que ejerce un papel protector. En suero, OPN se correlaciona positivamente con la edad en individuos y modelos animales con hígado normal. En los modelos animales, el aumento de los niveles de OPN en suero está relacionado con el aumento de los niveles en el hígado. La inducción de senescencia en células HepG2, a través de la modulación de p53, aumenta los niveles de OPN celular y su secreción. OPN está regulada para mantener el equilibrio del metabolismo lipídico del hígado durante el envejecimiento. La deficiencia de OPN en ratones hace que el hígado sea más vulnerable a la hepatoteatosis asociada a la edad, siendo el mecanismo subyacente el aumento de la lipogénesis de novo asociada a la senescencia y a una alteración de la respuesta al estrés de retículo debido a la disminución de los niveles de la chaperona GRP78.

PTEN es uno de los genes supresores tumorales mutados con mayor frecuencia en cánceres humanos. La proteína PTEN se pierde parcial o totalmente en una gran cantidad de tumores, lo que la convierte en un excelente candidato biomarcador en oncología clínica. En primer lugar, hemos optimizado el rendimiento de la mutagénesis dirigida con el objetivo de poder obtener un gran número de mutaciones de PTEN con la mayor eficacia posible. En segundo lugar, hemos caracterizado molecularmente los epítopos de la región C-terminal de PTEN reconocidos por anticuerpos monoclonales (AcM) anti-PTEN utilizados en inmunohistoquímica. Nuestro análisis puede contribuir a la validación de AcM anti-PTEN como herramientas de diagnóstico y pronóstico en oncología clínica, facilitando un diagnóstico de cáncer más preciso basado en la expresión del supresor tumoral PTEN. Por último, hemos caracterizado funcionalmente las mutaciones N-terminales de PTEN hereditarias y encontradas en tumores. Nuestros resultados indican que la localización subcelular y la actividad fosfatasa de PTEN dependen de la integridad de su extremo N-terminal. Asimismo, hemos encontrado diferencias entre las variantes N-terminales de PTEN y PTEN-L en tumores genitourinarios. Nuestros resultados sugieren una regulación funcional de PTEN específica de isoformas, lo cual sería relevante en la patogenicidad causada por las alteraciones en estas proteínas.

El retrómero es un complejo multiproteíco que participa en múltiples etapas del tráfico vesicular, controlando el reciclaje de cargos presentes en los endosomas a la membrana plasmática, la red Trans-Golgi, así como a diferentes orgánulos distales. Debido a su papel esencial, el retrómero está implicado en numerosos procesos fisiológicos y patológicos de gran relevancia. En este trabajo, hemos caracterizado estructural (cristalografía de rayos X) y funcionalmente la unión del retrómero con el efector de Legionella pneumophila, RidL, así como con diferentes proteínas accesorias y los cargos implicados en la enfermedad de Alzheimer APP y BACE. Todo ello, con el fin de contribuir al establecimiento de un modelo organizativo del retrómero que ayude a entender las bases moleculares que rigen el reconocimiento y selección de receptores transmembrana de manera específica, evitando su degradación en los lisosomas.

La enfermedad celíaca (EC) es una enfermedad autoinmune que se desarrolla en personas con susceptibilidad genética. Los haplotipos HLA-DQ2 y HLA-DQ8 representan alrededor del 40% de la contribución genética a la EC. En total, junto con otras variaciones genéticas comunes identificadas, podemos explicar el 50% de la heritabilidad de la enfermedad. Sin embargo, otras capas de información genómica independientes de la variación de la secuencia del ADN también podrían contribuir a la patogénesis de la EC. En esta tesis, los datos públicos de diferentes capas ómicas se han utilizado para identificar los mecanismos genéticos y epigenéticos de regulación génica que podrían estar involucrados en la patogénesis de la EC. Los experimentos previos de microarrays de expresión de nuestro grupo, los resultados del proyecto Immunochip, la información publicada sobre TADs y los datos de metilación y expresión generados recientemente se han recopilado y vuelto a analizar. Esto nos ha permitido identificar nuevos elementos reguladores y regiones genómicas involucradas en el desarrollo de la CD. Así, hemos podido observar que la gliadina influye en los cambios de co-expresión observados en la EC mediante los factores de transcripción CREB1 y IRF1. Además, la estructura 3D del genoma podría regular la co-expresión local, y la gliadina provoca cambios agudos en la metilación del ADN incluso en individuos no celíacos. En conclusión, los reguladores genéticos y epigenéticos identificados podrían estar involucrados en la patogénesis de la enfermedad y constituir nuevas dianas de intervención.

El Magnesio, segundo catión intracelular más abundante, es un ión imprescindible en diversas funciones vitales como la neurotransmisión, la conductancia cardiaca o la síntesis de ATP. Este papel biológico trascendental exige una homeostasis cuidadosamente regulada, en la que participan un número aún indeterminado de proteínas. De todas ellas, una de las familias menos estudiadas es la de los factores homeostáticos CNNM (¿Cyclin and CBS domain divalent metal cation transport mediators¿), inicialmente bautizados como Ancient Domain Proteins (ACDPs). Los CNNMs incluyen cuatro miembros (CNNM1-CNNM4) que presentan un patrón de expresión ubicuo, exceptuando CNNM1 que es predominante en el cerebro. La relevancia biológica de estas proteínas se hizo visible al descubrir que una deficiencia en su actividad, debida a la presencia de mutaciones, estaba ligada al desarrollo de diferentes patologías hereditarias de escasa prevalencia y origen recesivo, como la hipomagnesemia familiar dominante (CNNM2), o el síndrome de Jalili (CNNM4). Estudios más recientes han revelado su implicación en enfermedades de alta prevalencia, como el Alzheimer, el cáncer, la infertilidad, o desórdenes neuropsiquiátricos como la esquizofrenia asociados a un desarrollo anómalo de las estructuras cerebrales. Entre los hallazgos más llamativos se encuentra la habilidad de los CNNMs de interaccionar con tirosina fosfatasas de la familia PRL (Phosphatases of the regenerating liver), reconocidos marcadores de oncogénesis y metástasis. La formación de estos complejos induce un aumento de la concentración intracelular de Mg2+, que es aprovechada por las células tumorales tumores para proliferar e invadir otros tejidos, aunque los mecanismos moleculares implicados en este proceso se desconocían hasta ahora. Estructuralmente, los CNNMs son proteínas complejas e intrínsecamente dinámicas, sujetas a drásticos cambios conformacionales inducidos por la unión de fosfonucleótidos e iones Mg2+. Su estructura multimodular incluye cuatro regiones independientes bien diferenciadas, unidas por largos segmentos peptídicos desestructurados y presumiblemente flexibles. Estas características han convertido tradicionalmente su cristalización y posterior análisis estructural en un gran desafío debido a la naturaleza intrínseca de los CNNMs, con regiones transmembranosas y fragmentos flexibles intra e intermodulares a lo largo de su cadena polipeptídica. En esta tesis, analizamos las estructuras cristalográficas de los dos dominios intracelulares de la proteína CNNM4, además de la estructura en solución de la región intracelular completa utilizando la técnica de SAXS. Estas estructuras, suponen el estudio estructural más exhaustivo que existe hasta la fecha, y avanza en la comprensión de los mecanismos mediante los cuales las proteínas CNNM median el transporte de Mg2+. Además, también hemos dilucidado las bases estructurales de la interacción oncogénica entre el primer dominio intracelular de CNNM2 y PRL-1. Esta estructura, sienta las bases del futuro diseño de moléculas que inhiban la interacción entre ambas proteínas, frenando por tanto la progresión tumoral.

El deterioro cognitivo presenta hoy en día altas tasas de prevalencia en todo el mundo, siendo una característica común en muchas enfermedades neurológicas y neurodegenerativas. Sin embargo, y a pesar de la gravedad del problema, no existen terapias que combatan dicho deterioro de manera efectiva. Estudios previos demostraron que la transmisión sináptica mediada por receptores AMPA es crucial para la mejora cognitiva, sugiriendo, además, que una estrategia emergente para la mejora cognitiva podría basarse en facilitar los mecanismos para la potenciación sináptica e inhibir los procesos subyacentes a la depresión sináptica, para fortalecer así las sinapsis neuronales. Considerando la asociación entre la función sináptica y cognitiva, el principal objetivo de esta tesis doctoral ha sido desarrollar un novedoso ensayo de cribado para el descubrimiento de posibles potenciadores cognitivos basados en su capacidad para mejorar la liberación dependiente de actividad de receptores AMPA a la sinapsis. Este método ha demostrado sensibilidad y eficiencia en la detección de las dos formas principales de plasticidad sináptica, LTP y LTD, que son clave para el aprendizaje y la memoria y, por lo tanto, para la mayoría de las enfermedades neurológicas y neurodegenerativas. Además, se ha validado su potencial como un ensayo de cribado evaluando su capacidad para detectar eficazmente potenciadores cognitivos previamente descritos. Este trabajo constituye la base para el futuro desarrollo de un ensayo de cribado de alto rendimiento para el descubrimiento de potenciadores cognitivos.

Las células ganglionares de la retina (RGCs) son las únicas neuronas aferentes de la retina y transmiten la información visual al cerebro a través de sus axones, que forman el nervio óptico y su muerte causa una ceguera irreversible. Las RGCs se encuentran en estrecho contacto con las células de Müller. Estudios previos del grupo de investigación en el que se ha realizado esta Tesis doctoral, han demostrado que las células de Müller, las células gliales más importantes de la retina, entre sus múltiples funciones, son capaces de neuroproteger a las RGCs. Sin embargo, la heterogeneidad dentro de estas poblaciones de células y su capacidad de respuesta a diferentes estímulos puede cambiar en relación a la capacidad neuroprotectora de las células de Müller y, en consecuencia, influenciar en la supervivencia de las RGCs. La presente tesis doctoral se basa en el estudio in vitro de las células ganglionares de la retina (RGCs) en interacción con las células de Müller en diferentes condiciones. Para estudiar los mecanismos por los cuales las células de Müller pueden contribuir a la neuroprotección de las RGCs y la relación entre estos dos tipos celulares tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, hemos establecido cultivos primarios de células de Müller de mamíferos adultos. Debido a la importancia de estas células en la retina, hemos diseñado un protocolo fiable, rápido y sencillo para facilitar su estudio y la caracterización de estas células in vitro.

La hipercolesterolemia familiar es una enfermedad genética autosómica dominante que se caracteriza por unos niveles altos de colesterol en plasma. Este colesterol, con el tiempo se acumula en las paredes vasculares y favorece la aparición de la enfermedad cardiovascular. En esta tesis, se han estudiado los mecanismos genéticos y moleculares relacionados con el desarrollo de la hipercolesterolemia familiar con el objetivo de desarrollar diagnósticos inequívocos que permitan una pronta detección de la enfermedad y evitar así la posible aparición de problemas cardiovasculares futuros. Para ello, se han estudiado y caracterizado múltiples variantes del receptor de la LDL (LDLR), de la apolipoproteina B100 (APOB100) y de la protein convertasa subtilisin kexin 9 (PCSK9) proteínas todas ligadas a la captación de las LDLs del plasma. La caracterización de variantes de LDLR y PCSK9 llevadas a cabo en esta tesis ha permitido clasificar las diferentes variantes dependiendo de su grado patogenicidad y del fallo que provocan en el mecanismo de captación de las LDLs favoreciendo no solo el diagnostico preciso de la enfermedad sino la posible implementación de un tratamiento personalizado. La caracterización de las variantes de APOB por su parte ha permitido cuantificar su grado de patogenicidad y ha demostrado una participación activa de la APOB en el des-ensamblaje de la LDL de su receptor en el endosoma. Por otra parte, se ha estudiado la el efecto del microRNA (miR) miR-27b en el desarrollo de Diabetes Mellitus tipo 2. El miR-27b es un microRNA relacionado con el metabolismo lipídico que ve aumentada su expresión en modelos animales tratados con dietas enriquecidas en grasas y en personas que padecen obesidad.Por otro lado, en ambos casos el desarrollo de resistencia a la insulina es también un denominador común. Es por ello que el objetivo de este apartado de la tesis ha sido demostrar la causalidad existente entre ambos hechos. Los datos obtenidos en esta tesis indican que el miR-27b favorece el desarrollo de la resistencia a la insulina debido a que es un inhibidor especifico del receptor de la insulina y por lo tanto altos niveles de miR-27b generan un señalización por insulina disfuncional.

Tesi honen helburua Athletic Clubeko zerbitzu medikuaren lesioaren kudeaketa hobetzeko 3 galdera erantzutea izan zen. 1. Ikerlanean, gizonezkoen eta emakumezkoen lesioen epidemiologian ezberdintasunak daudela, eta prebentzio estrategiak bakoitzaren beharretara egokitu behar direla azalarazi zen. 2. Ikerlanean, 37 nukleotido bakarreko polimorfismo eta iskiotibialetako lesio muskularren arteko asoziazioa ikertu zen gizonezko jokalari helduetan. Nahiz eta 5 polimorfismo eta adina lesionatzeko arriskuarekin asoziatu ziren, ereduak ez zuen lesioak aurresateko gaitasunik eduki denboraldi independente batean, eta genetikaren erabilera lesioei dagokienez goiztiarra da. 3. Ikerlanean, lesioek harrobiko gizonezko jokalarien progresioan eta Lehen taldera iristeko aukeretan inpaktu negatiboa dutela demostratu zen. Lesioaren kudeaketa lehentasun bat da goi-mailako harrobietan, eta informazio hau jokalarien, entrenatzaileen eta zuzendarien atxikimendu maila handitzeko erabili daiteke. Galdera hauen erantzunetatik harago, garrantzitsua dena erantzunak bilatzeko prozesua da. Ebidentzian oinarritutako prozesu hau klubetan eta profesional bakoitzaren praktikan txertatzea helburu garrantzitsua da etorkizunera begira, jokalarien errendimendua eta lesioaren kudeaketa hobetzeko beste pauso bat.

Introduction: Disorders of sex development (DSD) encompass a high heterogeneous range of conditions in which the optimal clinical management of the individuals comprise clinical description, biochemical testing and genetic analysis. With the arrival of next-generation sequencing (NGS) new genes and pathways have been implicated in the pathogenesis of the disease. However, only 50% of the 46,XY DSD patients will receive a definitive diagnosis. The aim of this work is the clinical and molecular characterization of a DSD cohort. Patients and methods: Blood samples or DNA from a total of 125 independent patients with a DSD referred from several Spanish centres and one Swiss hospital were studied. Clinical characterization was done after examination of the data sheet provided by the clinicians. The molecular study was performed either by single-gene testing or NGS using a targeted gene panel of 48 DSD-related genes. Parents were also analysed when possible. Genetic variants were analysed using in silico prediction programmes and were classified according to its potential pathogenicity. Further functional studies of the genetic changes identified in three genes were also performed. Results: Overall, we made a genetic diagnosis in 4.4% of the individuals. In 46,XY DSD, the diagnostic rate increased up to 46.5% while in 46.XX DSD it was 29.2%. Novel changes classified as pathogenic or likely pathogenic were mostly located in the NR5A1 and LHCGR genes. Functional impact of variants in NR5A1 and LHCGR showed a significant reduced transactivation activity while the variant of unknown significance in GATA4 showed similar activity compared to wild type. Conclusions: The heterogeneous phenotypes encompassed in this condition difficult the clinical diagnosis and highlight the need of a genetic study. The molecular analysis of DSD-related genes identified a causative genetic variant in the 40.2% of the patients analysed in this cohort. Targeted gene sequencing panel is useful for the detection of singlenucleotide variants, however further improvements are needed to detect copy number variations. Functional studies are a valuable tool to confirm the effect of a variant in the pathogenesis of the disease.

La diabetes mellitus es un complejo trastorno metabólico caracterizado por la presencia de hiperglucemia crónica, debida a una insuficiente secreción de insulina o a la disminución de la respuesta de los tejidos a la misma. Aunque la etiología de la enfermedad es muy diversa, el 95% de los casos de diabetes en pediatría corresponden a una diabetes tipo 1, que se caracteriza por la destrucción autoinmune de las células ß pancreáticas productoras de insulina y por la generación de autoanticuerpos que sirven como marcadores para el diagnóstico. Es un tipo de diabetes poligénica en la que el sistema HLA tiene un papel importante en la susceptibilidad a desarrollar la patología. En un pequeño porcentaje de niños y adolescentes con clínica de diabetes tipo 1, no se detecta autoinmunidad basada en los marcadores clásicos (IAA, GADA e IA2A). El autoanticuerpo de más reciente identificación es el ZnT8A que podría considerarse un nuevo marcador predictivo y diagnóstico de autoinmunidad. Otro tipo de diabetes presente en pediatría es la diabetes monogénica. Se trata de un grupo heterogéneo poco común de diabetes no autoinmune, asociado a alteraciones en genes relacionados con el desarrollo de la célula ß pancreática, con la síntesis de insulina o con su función. La mayor parte de las características clínicas no son específicas de este tipo de diabetes y se estima que un alto porcentaje de casos permanecen sin diagnosticar o se diagnostican erróneamente como diabetes tipo 1 o tipo 2. Los casos pediátricos con diabetes tipo 2 son excepcionales en poblaciones caucásicas. En este trabajo se ha desarrollado un radioinmunoensayo para analizar ZnT8A y se ha evaluado su contribución para mejorar el diagnóstico de autoinmunidad en pediatría, obteniéndose un incremento de la sensibilidad diagnóstica de diabetes tipo 1, especialmente en adolescentes. Asimismo, se ha desarrollado mediante secuenciación masiva un panel de genes orientado al diagnóstico de diabetes monogénica, para establecer la prevalencia de esta patología en pacientes pediátricos con clínica de diabetes tipo 1 y marcadores de autoinmunidad negativos. Se ha encontrado que al menos un 8% de pacientes con estas características son portadores de una variante patogénica en heterocigosis causante de diabetes monogénica, y se han beneficiado de un tratamiento personalizado y de un adecuado consejo genético. Por último, se ha valorado la utilidad del genotipo HLA-DRB1 para seleccionar los pacientes a los que realizar un estudio genético para descartar una forma monogénica de diabetes y, aunque la presencia de dos alelos HLA-DRB1 de riesgo aumenta la probabilidad de desarrollar una diabetes autoinmune, el genotipo HLA-DRB1, considerado de forma aislada, muestra una escasa validez para la selección de pacientes pediátricos con clínica de diabetes tipo 1 y sin autoinmunidad que puedan beneficiarse de un estudio genético.

La reactivación de agregados proteicos en metazoos se logra mediante la actividad combinada de chaperonas de las familias Hsp70, Hsp40 y Hsp110. Apg2 humana estimula la reactivación de agregados ordenados y desordenados de proteínas por Hsc70 (HspA8). Junto con DnaJB1, Apg2 sirve para nuclear moléculas de Hsc70 en sitios donde se pueden desarrollar fuerzas de tracción entrópicas productivas. El origen de la especialización de Apg2 en el replegamiento de proteínas agregadas esta aún poco definido. En esta Tesis se ha estudiado cómo Apg2 regula la actividad chaperona de Hsc70 por la que se reactivan agregados proteicos. Además, se ha investigado la función que desempeñan los dominios divergentes de Apg2, el subdominio acídico (AS) y la extensión C-terminal, en este proceso. Los resultados obtenidos demuestran que Apg2 potencia la actividad replegadora del sistema de Hsc70 incrementando la cantidad de moléculas de la chaperona unidas a la superficie del agregado, mediante un mecanismo compatible con su actividad como intercambiador de nucleótidos. Ambos dominios divergentes se encuentran implicados en la optimización y especialización funcional de Apg2: el AS desestabiliza el complejo con Hsc70 de modo que facilita su disociación y la progresión del ciclo funcional, mientras que la extensión C-terminal decelera el intercambio ADP/ATP al interaccionar con el NBD de Hsc70 de una forma dependiente de la unión nucleótidos, lo que a su vez incrementa significativamente la estabilidad el complejo.

La presente tesis se ha centrado el estudio de las interacciones lípido-lípido asociadas a la segregación lateral de esfingolipidos y colesterol. Estos estudios se han llevado a cabo utilizando sistemas de membranas modelo compuestos por tres o cuatro componentes, y utilizando diferentes técnicas biofísicas, principalmente calorimetría diferencial de barrido, espectroscopia y microscopía de fluorescencia y microscopía de fuerza atómica, con los siguientes objetivos: ¿Caracterizar la estructura de las fases de la eSM y la pSM por debajo de su temperatura de transición principal de fase. ¿Analizar el comportamiento de la ceramida y el colesterol con un fosfolípido saturado en un sistema modelo de tres componentes. ¿Estudiar el efecto de la incorporación de esfingolipidos insaturados en membranas fosfolipídicas modelo. ¿Describir la interacción de glicoesfingolipidos naturales (cerebrósidos) en sistemas binarios con esfingolípidos, glicerolípidos o colesterol.

El interés por las microalgas ha aumentado considerablemente en la última década, principalmente como fuente para la obtención de biocombustibles, como alternativa a los productos fósiles empleados hoy en día. Actualmente, se ha visto que a partir de biomasa microalgal no solo se pueden obtener materias primas para obtener biocombustibles, sino que también, esta biomasa es de utilidad para obtener bioproductos de interés en los sectores farmacéutico, alimentario, cosmético y de química fina, entre otros. Por lo tanto, la biomasa microalgal sería de utilidad para proporcionar de forma sostenible y renovable muchos bioproductos de interés, permitiendo conseguir energías limpias, sostenibles y renovables, además, de otros bioproductos de valor añadido limpios y biodegradables. Esto sería la base, de lo que denominamos, biorrefinería a partir de microalgas. La mayoría de los estudios realizados proponen la utilización de microalgas para la obtención de biodiesel a partir de sus triglicéridos esterificables con alcoholes (metanol o etanol). Pero la biomasa microalgal contiene muchos más compuestos útiles, además de los lípidos, como azúcares y almidones fermentables, que pueden emplearse en la obtención de bioetanol. Otros productos intracelulares también pueden emplearse en los sectores farmacéutico, cosmético, alimentario y de química fina. Está claro que, si la biomasa microalgal sólo se emplea para extraer lípidos de utilidad para obtener biodiesel, el coste económico del cultivo algal y la extracción de los lípidos, así como las infraestructuras necesarias para realizar estos procesos, no son económicamente viables, ya que son procesos costosos y que requieren energía. Por lo tanto, la solución a este inconveniente es el aprovechamiento integral de la biomasa microalgal, que puede emplearse en la obtención de muchos y diversos bioproductos de interés. En este trabajo, se han estudiado distintos métodos de cosecha de microalgas que permitan recolectar esta biomasa de la forma más eficiente y económicamente viable. Para ello, se han adsorbido a nanopartículas magnéticas, como un método de cosecha rápido, fácil y no contaminante. Además, estas nanopartículas pueden ser recuperadas y reutilizadas, disminuyendo el coste de la cosecha. Por otro lado, se ha empleado la cosecha por centrifugación, como un método poco agresivo para los bioproductos intracelulares presentes en las microalgas. Sin embargo, la extracción del contenido microalgal de forma completa es un punto crucial del proceso y, debido a las complejas

La continua dependencia de los combustibles fósiles como fuente de energía ha afectado a nuestro medio ambiente dando lugar al fenómeno del calentamiento global. Una alternativa sostenible y renovable a éstos es el empleo de biocombustibles, como el biodiésel obtenido a partir de aceite de microalgas. En este trabajo se ha obtenido biodiésel a partir de biomasa de las microalgas Chlorella vulgaris var L3 y Scenedesmus sp., mediante catálisis enzimática de sus lípidos, utilizando mCLEAs. Este biocatalizador magnético se ha obtenido al inmovilizar mediante entrecruzamiento la lipasa B de Candida antarctica (CALB) con nanopartículas magnéticas (MNPs). Para hacer económicamente viable la obtención de biodiésel a partir de microalgas se han de optimizar todos los pasos de su producción, en especial el proceso de transesterificación. Las mCLEAs son capaces de transesterificar aceites microalgales en unas condiciones de reacción mucho más ventajosas económicamente (menor temperatura, relación de alcohol y cantidad de enzima) que las de otras investigaciones similares. Además, el carácter magnético de las mCLEAs permite su fácil recuperación haciendo posible su reutilización durante al menos 50 ciclos catalíticos consecutivos, sin pérdida de actividad, lo que conlleva una importante reducción de su coste y, con ello, de la producción de biodiésel, haciendo que este biocombustible pueda llegar a ser económicamente competitivo frente al combustible fósil.

Las Anemias Hemolíticas Congénitas (AHC) constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades caracterizadas por un incremento en la destrucción de hematíes en sangre periférica o menos frecuente por un aumento de la apoptosis intramedular por eritropoyesis ineficaz de los eritroblastos maduros [1,2], su causa siempre está ligada a un defecto genético, pudiendo ser la alteración en el ADN por herencia o nueva mutación. Son enfermedades de tan baja prevalencia que se incluyen en la categoría de enfermedades raras < 250.000 pacientes (5/10.000) [3]. Debido a que estas enfermedades afectan solo a unos pocos o cientos de individuos, ha sido un reto desarrollar herramientas diagnósticas y tratamientos para estos pacientes. El conocer la mutación causante de la AHC permitirá un mejor conocimiento de la biología de la enfermedad y será útil para la identificación de portadores dentro de la familia, lo que a su vez facilitará un adecuado consejo genético y de ser necesario llevar a cabo un adecuado diagnóstico prenatal o pre-implantacional. Por tanto, la detección de las mutaciones causantes de estas patologías va a ser una herramienta eficaz no solo en el correcto diagnóstico sino también en la prevención del riesgo de nuevos casos.

Malformación de la membrana de núcleos esta observada en casos de distrofia muscular, así como en ciertos tipos de cáncer, como el de mama o el de riñones. Los mecanismos que intervienen en la integridad de eta membrana están controlados por las interacciones proteíns con lípidos. Hace poco, se ha demostrado que las propiedades físicas de lípidos específicos tienen una función esencial en el proceso de formación de la membrana de núcleos en el modelo del erizo de mar. Para comprender como la arquitectura de la membrana está regulada, utilizamos técnicas cuantitativas como la espectrometría de mesa y la RMN para determinar la composición en lípidos de la membrana y sus propiedades dinámicas. La extracción del núcleo se realizó a partir de células renales humanas, HEK 293T. Se ha optimizado una extracción física basada en un tratamiento a presión y un gradiente de sucrosa para obtener una gran cantidad de núcleos intactos (lípidos de la membrana nuclear) necesarios para nuestros experimentos. Estos núcleos purificados incluyen un mínimo de residuos celulares, retículo endoplásmico y apartato golgi. Después, lípidos de núcleos han sido extraídos con un método de Folch modificado. Los experimentos de RMN en líquidos mostraron que la membrana nuclear estaba compuesta de muchos tipos de fosfolípidos y de los cuales la fosfatidilcolina era el lípido principal. Además, la composición muestra una gran proporción de fosfatidilcolina en comparación con otros tipos de membranas. Experimentos de espectrometríaa de masa han demostrado que la membrana nuclear estaba compuesta principalmente de fosfolípidos altamente insaturados y con cadenas que contenían un promedio de 34 átomos de carbono. Los análisis por RMN del sólido realizados en membranas reconstituidas a partir de lípidos de núcleos han revelado propiedades físicas atípicas. La temperatura de transición de fase fluido-gel está muy baja y amplia (-10Cº-15ºC)lo que puede venir de la presencia de muchas especias de fosfolípidos y numerosas insaturaciones. Además, a 25ºC, las membranas reconstruídas están más rígidas que las membranas modelas convencionales, lo que implica que el espesor de membrana está más largo que la de membranas modelas. Al final, los liposomas de membranas reconstituídas muestran una muy importante deformación en elipsoide prolato en el campo magnético, lo que es muy atípico para membranas biológicas y sugiere una importante elasticidad de curvatura de la membrana.

El Síndrome de Townes-Brocks (TBS1, MIM 107480 ) está causado por mutaciones en el gen SALL1, dando lugar, en la mayoría de los casos, a una proteína truncada. TBS se caracteriza por un espectro de malformaciones en dedos, oídos, corazón y riñones. Curiosamente, estos síntomas coinciden con aquellos observados en un número creciente de enfermedades y síndromes genéticos ligados a la formación y función del cilio primario conocidos como ciliopatías. Hasta ahora, el estudio del TBS se ha centrado en los defectos que, a nivel transcripcional, las mutaciones en SALL1 podrían ocasionar en el núcleo. Sin embargo, en esta tesis postulamos que las truncaciones en SALL1 podrían interferir con la función o señalización de los cilios debido a su interacción dominante negativa con proteínas del centrosoma o del cilio primario. Hemos descubierto que la proteína SALL1 truncada causa un incremento de la ciliogenesis y de la señalización de la vía Sonic-Hedgehog (Shh). También descubrimos que la forma truncada de SALL1 interactúa con los reguladores negativos de la ciliogénesis CCP110 y CEP97, posiblemente desestabilizándolos o desplazándolos del centríolo madre que da lugar al cilio primario y permitiendo, por tanto, la ciliogenesis. Además, SALL1 interactúa con la proteína LUZP1 que contiene cremalleras de leucina y tiene un papel fundamental durante el desarrollo. De hecho, el modelo de ratón knock-out de LUZP1 fenocopia algunas características asociadas con ciliopatías humanas, como defectos del tubo neural o de la formación del corazón. Nuestros datos respaldan el descubrimiento de que LUZP1 puede participar en la integración de la ciliogénesis y la dinámica de la actina durante el desarrollo.

En esta tesis doctoral hemos corroborado que tanto una correcta función mitocondrial como la homeostasis de proteínas son fundamentales para el correcto funcionamiento del hígado y que alteraciones en ambos procesos están asociados con la lesión hepática. Hemos descubierto nuevos mecanismos subyacentes de la enfermedad hepática, a nivel mitocondrial y de modificaciones post-traduccionales que podrían ayudar al desarrollo de nuevos fármacos y terapias para su tratamiento. Concretamente, hemos descrito que MCJ es un regulador negativo del metabolismo mitocondrial en hígado y que su expresión está altamente implicada en el daño hepático por fármacos y en hígado graso no alcohólico. De manera importante, hemos demostrado que la deficiencia en MCJ podría ser una terapia prometedora para estas enfermedades, ya que su silenciamiento en modelos experimentales animales ha resultado muy efectivo, manteniendo las mitocondrias activas y evitando el daño hepático y la progresión de la enfermedad. Por otro lado hemos descrito que la proteína mitocondrial PHB1 tiene un papel en colestasis, ya que sus niveles se encuentran disminuidos específicamente en pacientes con enfermedades colestásicas y que su deficiencia predispone al daño por ligadura del conducto biliar. Hemos visto que en colestasis, a parte de su función mitocondrial, bajos niveles de PHB1 regulan la actividad del proteosoma e inducen cambios transcripcionales a través de la sobreexpresión y localización nuclear de HDAC4. En este respecto, hemos observado que la disminución de la expresión de HDAC4 mejora el daño hepático asociado a la deficiencia de PHB1. Finalmente, hemos presentado evidencias sobre el importante papel de la nedilización en el desarrollo del CHC y hemos identificado LKB1 y Akt, conocidas oncoquinasas, como nuevas dianas de Nedd8. Tanto el grado de nedilización como los niveles de LKB1 y Akt se asocian a un peor pronóstico. Además, hemos demostrado que inhibir la nedilización bloquea el crecimiento tumoral y mejora el estado del hígado pudiendo ser una buena terapia para pacientes con carcinoma hepatocelular.

Chronic liver disease refers to a wide group of pathologies caused by several damaging agents and characterized by a slow progression and final development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). It represents one of the most frequent causes of mortality in Western countries and its increase in last years and the lack of effective treatment highlight the necessity of the better characterization of the disease. Dysregulation of methionine and S-adenosylmethionine (SAMe) metabolism and enzymes participating in the methionine cycle has been implicated in chronic liver disease. Glycine N-methyltransferase (GNMT), the most important SAMe-catabolizing enzyme, is downregulated in liver pathologies such as NAFLD, cholestasis, fibrosis, cirrhosis and HCC. Nevertheless, there are few studies describing its downregulation in liver disease, which may be of interest to develop targeted therapies. We describe novel microRNAs (small non-coding RNAs that regulate gene expression at the posttranscriptional level by mRNA repression) repressing GNMT in chronic liver diseases such as NAFLD, cholestasis and fibrosis and HCC. MiR-873-5p regulates GNMT in NAFLD. Moreover, we describe new functions of mitochondrial GNMT essential for OXPHOS and ß-oxidation processes. Inhibiting this microRNA results in increased cytoplasmic and mitochondrial GNMT levels, enhanced Complex II activity in the ETC and sustained ß-oxidation, avoiding lipid accumulation, inflammation and fibrosis. This microRNA also participates in cholestatic fibrosis, targeting GNMT in hepatocytes, cholangiocytes, inflammatory and fibrogenic cells. Inhibition of miR-873-5p recovers GNMT expression in the different hepatic cell types, avoiding SAMe accumulation and aberrant DNA methylation in the liver, which finally results in an appropriate response and defense against bile acid induced liver damage. Finally, we identify miR-518d-5p is upregulated in HCC acting as an oncomiRs and conferring drug resistance to sorafenib hepatoma cells through the repression of GNMT and c-Jun. Inhibiting this microRNA upregulates the expression of both target genes resulting in increased sorafenib induced apoptosis through mitochondrial dysfunction.

La enfermedad hepática crónica es un término que incluye una larga lista de patologías hepáticas y que suele finalizar con la pérdida de integridad del parénquima hepático degenerando en cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC). La enfermedad hepática crónica puede estar causada por distintas etiologías, como la infección por los virus de la hepatitis B y C, toxinas, consumo de alcohol y drogas, enfermedades autoinmunes y hereditarias y la enfermedad del hígado graso no alcohólica (EHGNA). Se han investigado múltiples mecanismos moleculares que dan lugar a la enfermedad hepática crónica, aunque hoy en dia la contribución de las modificaciones postraduccionales a esta enfermedad es un área aún por estudiar. Las modificaciones postraduccionales (PTM) se producen por la conjugación reversible de una proteína o un grupo funcional a determinada proteína diana. Las PTM regulan tanto la activación como la inactivación de sus proteínas dianas, e inducen cambios en la localización celular, degradación/estabilidad, formación de complejos, etc. Dentro de las modificaciones postransduccionales, nuestros estudios se han dirigido a las denominadas ¿Ubiquitin like¿ (UBL), que incluyen todas las modificaciones ocasionadas por proteínas cuya función sea similar a la ubiquitina. Se estima que hay alrededor de 16 UBL con funciones y actividades distintas. Todas ellas comparten un ciclo de vida parecido con similitudes en su activación y procesamiento. Hoy en día, hay tres UBL que concentran la atención de la mayoría de las investigaciones: la ubiquitina, SUMO y NEDD8. NEDD8 (Neural precursor cell expressed developmentally downregulated-8) es una de las UBL más similares a la ubiquitina (59%) pero tiene dianas y funciones completamente distintas. La principal función de NEDD8 consiste en estabilizar las proteínas a las que modifica alargando su vida media. La proteína diana mejor conocida de esta UBL son las conocidas como ¿cullins¿ que forman parte de los complejos cullin-RING-ligases (CRL). Las CRL son complejos E3 que ubiquitinizan a una gran variedad de proteínas involucradas en distintos procesos celulares como el ciclo celular, crecimiento celular, replicación del ADN, y transmisión de señales. Recientemente, se han identificado nuevas dianas de NEDD8 diferentes a las CRL como son Mdm2, TßRII y HuR. Por su parte, SUMO (small ubiquitin-related modifier) es una UBL que está compuesta por 3 isoformas: SUMO1, SUMO2, y SUMO3. La unión de SUMO a diferentes proteínas diana esta mediada por una secuencia consenso para este motivo, y las modificaciones que provoca tienen varias funciones en su correspondiente diana. Entre las más relevantes se encuentran cambios en la localización celular y la actividad de la proteína diana, así como su capacidad de interacción con otras proteínas para la formación de diferentes complejos macromoleculares. El principal objetivo de este proyecto es el estudio de la contribución de las modificaciones postraduccionales al desarrollo de la enfermedad hepática crónica derivada del hígado graso no alcohólico en sus diferentes estadios: esteatosis, fibrosis y CHC. La EHGNA es una de las principales enfermedades hepáticas crónicas en los países desarrollados, y se encuentra asociada a factores de riesgo del síndrome metabólico (obesidad, resistencia a la insulina, dislipidemia e hipertensión), incluyendo alteraciones como la esteatosis hasta la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). Una alta proporción de pacientes con EHGNA sufren alteraciones en el metabolismo de la metionina y la S-adenosylmetionina (SAMe). SAMe es el principal donante de grupos metilo en el organismo y su síntesis está controlada por las enzimas metionina adenosiltransferasa (MAT) y glicina N-metiltransferasa (GNMT). GNMT metaboliza SAMe en la célula evitando su acumulación. En humanos, la pérdida de la expresión o la actividad de GNMT conlleva el desarrollo de EHNA, cirrosis y CHC. Centrándonos en el desarrollo de EHNA, hemos identificado recientemente que es la pérdida de la capacidad autofágica del hígado es uno de los mecanismos por los que se induce la acumulación de vesículas lipídicas en el hígado en ausencia de GNMT. En la autofagia, la célula recicla componentes citoplasmaticos mediante su secuestro en vacuolas y posterior fusión con lisosomas donde son degradados. En el modelo de ratón GNMT-KO (que desarrolla de forma totalmente espontanea EGHNA, cirrosis y CHC por la acumulacion crónica de SAMe) descubrimos que la autofagia estaba inhibida en los hepatocitos debido a una disfunción lisosomal. Este efecto resultó estar mediado por la regulación de la actividad de la fosfatasa PP2A a través de su metilación. Uno de los principales riesgos en el desarrollo de la enfermedad crónica EGHNA es su progresión a fibrosis, cirrosis y CHC. Durante la fibrosis se genera una matriz extracelular compuesta por colágeno y otras proteínas extracellulares. La célula principal implicada en la repuesta fibrótica es la célula estrellada (HSC). Las HSC se encuentran de un modo inactivo en un hígado sano presentando gotas de vitamina A en su citoplasma. Tras el daño hepático estas células se activan, reduciendo sus niveles de vitamina A, aumentando su motilidad y su producción de colágeno. Las HSC son actualmente una diana para el tratamiento de la fibrosis aunque todavía no se ha descubierto un tratamiento efectivo que pueda evitar o reducir su activación o inducir su muerte vía apoptosis. Nuestros resultados muestran que la PTM NEDD8 se encuentra aumentada en ratones y pacientes humanos con fibrosis. Este aumento ocurre en los principales tipos celulares del hígado: el hepatocito, la célula estrellada, y las células proinflamatorias de Kupffer. Por tanto, inhibiendo la NEDDilización se previno la aparición de la fibrosis en ratones en diferentes modelos de esta patología. Es importante señalar que la inhibición de esta PTM afecta de forma diferente a los distintos tipos celulares en el contexto fibrótico. En hepatocitos, la inhibición de la nedilizacion protege de la apoptosis, mientras que en las células de Kupffer previene la activacion y en las HSC induce la respuesta apoptótica a través de la estabilización de c-Jun. Nuestros resultados demuestran la importancia de la PTM NEDD8 en el desarrollo y la regresión de la fibrosis. Los pacientes cirróticos pueden progresar a CHC, siendo ésta la tercera causa de muerte por cáncer. El CHC aparece por la modulación (activación/inhibición) de diversas rutas de proliferación que se activan en los hepatocitos. La quinasa hepática B1 (LKB1) identificada previamente como un supresor de tumores por su habilidad en activar AMPK e inducir muerte celular se ve aumentada en pacientes con un CHC avanzado. En ausencia de GNMT tanto en pacientes como en el modelo de raton GNMT-KO, la actividad de LKB1 se encuentra inducida y se requiere su presencia para el desarrollo de fibrosis y CHC como se demuestra en el hígado completamente sano que presentan el modelo de raton doble KO Stk11/GNMT donde se anula la expresión de LKB1 en un entorno donde GNMT esta bloqueado. La característica que define la actividad protumoral de LKB1 en el hígado es su asociación con la via de RAS. Hemos podido identificar que tanto la inducción como el silenciamiento de LKB1 en modelos in vivo de ratón, así como en celulas de hepatoma, regula los niveles del activador de la via RAS, RAGRP3. Este hecho se produce tanto a nivel de ARN mensajero como de proteína. En este contexto es importante señalar que en CHC se detecta un aumento de la localización nuclear de LKB1 a pesar de que no se produzcan cambios significativos en su proteína adaptadora STRAD¿. Nuestros resultados demuestran que LKB1 se encuentra SUMOilado por SUMO2 y que esta modificación es la responsable de la pérdida de unión a STRAD¿ y de su posterior retención en el nucleo. Esta SUMOilación ocurre en la lisina 178 que se localiza dentro de la secuencia consenso para SUMO en LKB1. La SUMOilación de LKB1 aumenta en un entorno hipóxico característico de los tumores y requiere un paso previo de acetilación para que se produzca. La Sumoilacion de LKB1 y su localización nuclear confiere ventajas proliferativas y un mayor rendimiento metabólico a los tumores hepáticos. LKB1 nuclear actúa como un factor de transcripción regulando la actividad de genes proliferadores entre ellos RASGRP3. En conclusión, nuestros resultados muestran que las modificaciones postraduccionales tienen una contribución importante en la aparición de las distintas fases de la enfermedad crónica hepática. En esteatosis, la metilación contribuye a inhibir la autofagia mientras que la NEDDilización facilita la aparición de fibrosis. Finalmente la SUMOilación de la proteína LKB1 facilita la supervivencia y replicación de del tumor hepático.

Identificación de variantes genéticas implicadas en el desarrollo de dislexia y falta de atención. Estrategias caso-control y loci de rasgos cuantitativos La dislexia y el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH) son dos trastornos neuro-conductuales con una prevalencia alta. Ambos son trastornos complejos causados por múltiples riesgos genéticos y ambientales. Durante años se han asociado varios genes con estos trastornos, sin embargo, existe una gran discrepancia entre los diferentes estudios. La dislexia y el TDAH se clasifican habitualmente en grupos clínicos separados y se estudian independientemente, aunque comparten una gran fracción de la sintomatología, además co-ocurren más frecuentemente de lo esperado, y en algunos casos la dificultad en la lectura se ha relacionado con los síntomas de inatención. Las muestras utilizadas en este proyecto se han diagnosticado como disléxicas, con falta de atención o como controles, y un número de ellas padecen los dos trastornos (muestras comórbidas). En la presente tesis se ha tratado de identificar variantes genéticas que estén relacionadas con la habilidad para la lectura y con la atención, haciendo especial hincapié en la dislexia, la falta de atención y en la comorbidad de ambos trastornos. Para ello se han llevado a cabo estudios de asociación en base a dos grandes estrategias: genes candidatos y genoma completo (GWAS). Asimismo, dada la heterogeneidad sintomatológica dentro de los trastornos estudiados, se ha visto la oportunidad de analizar la variabilidad de ciertos rasgos cognitivos (medidas piscométricas cognitivas) en relación al genotipo. De esta forma, ambas estrategias a su vez, se han subdivido en dos metodologías de análisis: casos/controles y análisis de QTLs (Quantitative trait loci). 1.-Estudio de asociación de genes candidatos Diversos estudios vinculan diferentes genes con estos trastornos y aun observando que los resultados obtenidos no se replican entre las diferentes poblaciones, se ha querido comprobar si se asociaban en la población española. En este trabajo, se han examinado 7 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) y 2 VNTRs localizados en genes que previamente se habían asociado a la dislexia o al TDAH (KIAA319, DCDC2, DYX1C1, FOXP2, COMT, MAOA, DBH, DRD4 y DAT1), en una cohorte de niños españoles (N=2078) que padecían uno, ninguno o ambos trastornos (dislexia y FA). Los resultados han revelado que los valores de significancia de asociación de algunos marcadores varían notablemente cuando se consideran las muestras comórbidas dentro del grupo de casos, lo cual apoya la importancia de establecer diagnósticos rigurosos y homogéneos de estos trastornos cognitivos para poder identificar biomarcadores reproducibles. Además, se han detectado más asociaciones al considerar parejas de SNPs como variantes epistáticas. El análisis de QTLs con un total de 3414 muestras ha mostrado que las variantes genéticas están asociadas significativamente a los endofenotipos (medidas psicométricas relacionadas directamente con procesos cognitivos específicos), independientemente del trastorno conductual en el que se habían clasificado los individuos. Este hecho refuerza la importancia de investigar las medidas cuantitativas aplicadas a la definición de cada fenotipo en vez de centrarse solamente en los grupos categóricos extrapolados a partir de sus síntomas. 2.-Estudio de asociación de genoma completo (GWAS) Con el propósito de identificar nuevas variantes, se ha realizado un estudio de asociación de genoma completo para cada trastorno y para la comorbidad entre ambos. Gran parte de los SNPs más asociados en los tres estudios realizados se ubican en zonas reguladoras génicas de importancia y en genes de interés causal para estos trastornos. Es remarcable la asociación encontrada con un marcador del gen KANK1 y la dislexia, por lo que se considera éste polimorfismo y el gen KANK1 como potenciales candidatos de susceptibilidad a padecer dicho trastorno. En cuanto al análisis de QTLs con los datos de los GWASs, se han correlacionado los genotipos de todos los marcadores con 5 medidas atencionales y 5 medidas de lectura en la población general, es decir, independientemente del fenotipo de la muestra. Los resultados han identificado asociaciones de mayor significancia que las encontradas con la estrategia de caso/control, lo cual sugiere una vez más la importancia de este tipo de estrategia. Entre los resultados más importantes, destacan dos regiones ubicadas en los cromosomas 2 y 8 que se asocian significativamente con los procesos atencionales. Finalmente partiendo de los resultados obtenidos en el estudio de genoma completo también se ha querido hipotetizar sobre posibles rutas funcionales para cada uno de los trastornos así como para las funciones cognitivas analizadas. Entre las rutas que se encuentran enriquecidas de SNPs con mayor significancia de asociación con los trastornos y funciones cognitivas estudiados destacan las rutas relacionadas con la transmisión sináptica y la adhesión o estructuración celular. Además se proponen las rutas relacionadas con funciones lipídicas y el sistema inmunitario como candidatas para una posible explicación de dichos trastornos o rasgos cognitivos. En resumen, esta tesis examina los rasgos genéticos que influyen en la dislexia y la falta de atención y muestra evidencias de la importancia de evaluar la genética asociada a los endofenotipos, además de las categorías cualitativas de los trastornos basadas en la suma de los síntomas. Por otra parte, propone posibles genes causales, regiones cromosómicas y rutas funcionales que podrían encajar entre los múltiples orígenes de estos trastornos o de las funciones cognitivas relacionadas.

El sistema desagregasa humano, compuesto por representantes de las familias Hsp70 (Hsc70), Hsp40 (DnaJA2 y DnaJB1) y Hsp110 (Apg2) lleva a cabo una gran variedad de funciones cuya finalidad común es preservar la proteostasis celular. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido analizar la regulación de este sistema desde dos perspectivas. Por un lado, se ha caracterizado la diversificación funcional de Hsc70 mediada por las cochaperonas DnaJA2 y DnaJB1. Los resultados demuestran que mientras la asociación de Hsc70 con DnaJB1 aumenta la capacidad de desagregación y replegamiento del sistema, la presencia de DnaJA2 favorece la protección de los substratos proteicos frente a la agregación en detrimento de las funciones previamente nombradas. Particularmente, se ha determinado que la región del carboxilo terminal de DnaJA2, que adopta una conformación intrínsecamente desordenada, confiere a DnaJA2 estas propiedades, además de su capacidad para auto-asociarse. Por otro lado, teniendo en cuenta la dependencia de las células cancerosas de la actividad de las chaperonas Hsp70 y Hsp110, se ha estudiado el efecto de su inhibición por moléculas químicas en la viabilidad de células tumorales. Entre los compuestos químicos identificados mediante un cribado masivo, el bromuro de pinaverio ha mostrado citotoxicidad frente a células de melanoma y no frente a líneas celulares control. Por lo tanto, podría ser un compuesto potencial para la terapia contra este tipo de cáncer.

El reciclaje de proteínas es fundamental para mantener la homeostasis celular. Este trabajo se enfoca en el reciclaje de proteínas que llegan a los endosomas. Allí, las proteínas transmembrana (receptores) son recicladas en un sistema de membranas tubulares (conocido como ¿tubular endosomal network¿) que emergen de los endosomas y se distribuyen por la célula, en concreto hacia el aparato de Golgi y la membrana plasmática. Usando un enfoque multidisciplinar que implica distintas técnicas bioquímicas y de biología estructural, hemos caracterizado uno de los complejos involucrados en la selección de proteínas a reciclar y la deformación de membranas. En concreto, usando cristalografía y difracción de rayos X, hemos resuelto parte de la estructura de este complejo. Por otro lado, diversas técnicas bioquímicas nos han servido para observar la interacción de dicho complejo con una de las proteínas que recicla. Por último, usando la última tecnología en microscopía electrónica (conocida como crio-tomografía electrónica y promedio del sub-tomograma, o ¿cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging¿), hemos visto cómo dicho complejo se sitúa en la membrana y es capaz de formar tubos a partir de vesículas artificiales, o liposomas. Nuestro trabajo ayuda a la comprensión de los mecanismos de reciclaje celular, contribuyen a entender el sistema de membranas que emerge de los endosomas.

El desarrollo de esta tesis doctoral ha aportado luz sobre los mecanismos que subyacen a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD por sus siglas en inglés), ya que los resultados han revelado la existencia de al menos 2 subtipos diferentes de pacientes al comparar (mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas) el perfil metabolómico sérico de estos con el perfil metabolómico de dos modelos animales de esta enfermedad: ratones MAT1A-KO y 0.1MCD. Por otra parte, experimentos in vitro, in cellulo e in vivo han revelado parte del mecanismo de acción del Aramchol®, una molécula compuesta por un ácido biliar y un ácido graso saturado. El tratamiento con esta molécula en ratones 0.1MCD ha mostrado una clara reducción en la acumulación de grasa en el hígado, así como una disminución de la fibrosis y de un aumento en la capacidad antioxidante, todo ello disminuyendo los síntomas de esta enfermedad. Así mismo, el estudio clínico en humanos muestra el efecto del Aramchol en el metabolismo hepático de la glucosa, resultados que hemos complementado y validado en esta tesis con el modelo 0.1MCD. Por último, hemos caracterizado una cohorte de personas pertenecientes a población general, para determinar mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) una huella metabólica en orina que nos permita distinguir pacientes con síndrome metabólico de personas sanas

Oncogene addiction postulates that the survival and growth of certain tumor cells is dependent upon the activity of one oncogene, despite their multiple genetic and epigenetic abnormalities. This phenomenon provides a foundation for molecular targeted therapy and a rationale for oncogene-based stratification. We previously reported that the Promyelocytic Leukemia protein (PML) is upregulated in triple negative breast cancer (TNBC) and it regulates cancer-initiating cell function, thus suggesting that this protein can be therapeutically targeted in combination with PML-based stratification. However, the effects of PML perturbation on the bulk of tumor cells remained poorly understood. In this thesis work we demonstrated that TNBC cells are addicted to the expression of this nuclear protein. PML inhibition led to a remarkable growth arrest combined with features of senescence in vitro and in vivo. Mechanistically, we observed that growth arrest and senescence were associated to a decrease in MYC and PIM1 kinase levels, with the subsequent accumulation of cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (CDKN1B, p27), a trigger of senescence. In line with this notion, we found that PML is associated to the promoter regions of MYC and PIM1, consistent with their direct correlation in breast cancer specimens. Altogether, our results provide a feasible explanation for the functional similarities of MYC, PIM1, and PML in TNBC and encourage further study of PML targeting strategies for the treatment of this breast cancer subtype.

El antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) es un factor esencial en replicación y reparación de ADN en eucariotas. Forma un anillo homotrimérico que rodea y se desliza a lo largo del ADN, actuando como una plataforma de anclaje de enzimas que modifican el ADN y de proteínas reguladoras a la horquilla de replicación. Estas interacciones ocurren frecuentemente a través de una secuencia consenso de aminoácidos denominada motivo PIP que se une a un bolsillo hidrofóbico de PCNA. En esta tesis doctoral se estudian proteínas de unión a PCNA implicadas en la replicación y reparación del ADN, con el fin último de entender sus interacciones y función utilizando una aproximación estructural. Por un lado, se ha realizado un exhaustivo análisis conformacional de la proteína p15PAF doblemente monoubiquitinada y el impacto de esta modificación postraduccional en su unión a PCNA y a ADN. También ha caracterizado la interacción de la subunidad p12 de la polimerasa delta (pol ¿) humana con PCNA mediante RMN, calorimetría y cristalografía. Los resultados presentados en esta tesis contribuyen a entender mejor la organización y función de componentes esenciales de las maquinarias de replicación y reparación del ADN en la célula.

La Distrofia Miotónica 1 (DM1) es una enfermedad neuromuscular degenerativa multisistémica caracterizada por la expansión del trinucleótido CTG en el gen DMPK. Desde un punto de vista clínico gran parte de los rasgos característicos de esta enfermedad se asocian a un proceso de envejecimiento prematuro. El objetivo de esta tesis es investigar los procesos del envejecimiento y del riesgo a desarrollar cáncer en los pacientes con DM1. En esta tesis aportamos datos experimentales robustos que avalan que los pacientes con DM1 poseen alteraciones en varios procesos clave del envejecimiento fisiológico y que dichas alteraciones se pueden revertir mediante distintas aproximaciones antienvejecimiento, constituyendo éstas una nueva aproximación terapéutica para los pacientes con DM1. En este sentido encontramos alteraciones en la regulación de la proliferación celular, un mayor daño en el ADN, una senescencia prematura, una alteración del metabolismo y la dinámica mitocondrial, junto con un mayor acortamiento telomérico. Además, describimos un mayor riesgo a desarrollar tumores malignos en dichos pacientes. El tratamiento con compuestos antienvejecimiento como la metformina y los compuestos senolíticos, junto con una nueva familia de compuestos, rescatan parte de los procesos anteriormente alterados tanto en modelos in vitro como in vivo de la enfermedad.

- INTRODUCCIÓN E HIPÓTESIS: La Discapacidad Intelectual (DI) es un desorden del neurodesarrollo que afecta aproximadamente al 1-3 % de la población y que supone un serio problema, tanto médico como social, en los países desarrollados. La DI ligada al cromosoma X (XLID) representa un grupo importante, por haber más varones que mujeres con DI y en muchos casos se segrega además vía materna. En los últimos años, las tecnologías de secuenciación masiva (NGS), han contribuido de forma importante al diagnóstico de la XLID, lo que nos hizo plantear la HIPÓTESIS de que en nuestros pacientes sin filiar podríamos aplicar la NGS encontrando nuevos genes/variantes causantes de DI y aplicando estos resultados al diagnóstico y al Consejo genético en las familias. - OBJETIVOS: Se marcaron 3 objetivos, cuyos resultados siguen el mismo orden: - RESULTADOS: 1.- Se revisó la base de datos del laboratorio de los 1909 pacientes varones que llegaron para el estudio del gen FMR1 durante 1991-2015. Se seleccionaron 230 que tenían historia familiar (el 12%) y se cuantificaron y clasificaron los 59 diagnósticos moleculares ya obtenidos, la mayoría de los cuales estaban ligados al X (52/59), siendo el Síndrome X Frágil el más prevalente (43 casos) y demostrando ya la importancia de los genes del X en el origen de la DI (52/230=22,6%). 2.- Se diseñó un panel de 82 genes del X para aplicarlo por NGS a los casos sin filiar. En total se estudiaron con el panel 61 pacientes varones con posible DI ligada al X. Se identificaron 17 variantes candidatas en 16 pacientes (16/61=26.23%) y se pudieron recontactar 6 familias con 7 variantes para estudios de cosegregación. Esto hizo posible la interpretación de algunas variantes como patogénicas, probablemente patogénicas o benignas. 3.-Se validó el panel de genes del X comparándolo con el exoma completo en trio en 13 parejas de hermanos varones con DI. Aunque el panel de genes resultó en una tasa más baja de diagnóstico (1/13) que el exoma (4/13), el panel ofreció una mayor profundidad de cobertura de las regiones cubiertas y por lo tanto mejor detección de variantes. Finalmente, juntando los datos de estas 13 familias con las parejas de hermanos de la base de datos que ya tenían diagnóstico molecular (en total 45), se comprobó que la mayoría tenían variantes en el cromosoma X (15/45) por lo que la contribución del cromosoma X es del 33.33% en nuestra cohorte de parejas de hermanos con DI. - CONCLUSIONES: Este estudio demuestra la importante contribución de los genes del X en pacientes varones con DI e historia familiar, del orden del 22 al 33% en nuestra cohorte. Además, este trabajo ha demostrado la utilidad del panel de genes del X en el desciframiento de la DI ligada al X; ha puesto de manifiesto las limitaciones de los análisis de segregación y la necesidad de los estudios funcionales; y ha demostrado la necesidad de estudiar retrospectivamente los pacientes para aplicarles las nuevas tecnologías con el fin de lograr más y mejores diagnósticos genéticos moleculares.

Limb-girdle muscle dystrophy type R1 (LGMDR1) is the most common form of limb-girdle muscle dystrophy, currently with no effective treatment. LGMDR1 is caused by mutations in the CAPN3 gene and is characterized by reduced mobility, making daily live activities challenging. CAPN3 gene encodes calpain 3 protein (CAPN3), a non-lysosomal cysteine protease necessary for proper muscle function. Although the main function of CAPN3 in skeletal muscle and the pathophysiological mechanisms underlying the disease remain to be clarified, previous studies suggest that dysregulation of calcium (Ca2+) homeostasis is involved in the pathogenic mechanisms of this muscular dystrophy. In fact, our previous data suggest that CAPN3 deficiency may trigger calcium handling proteins dysfunction such as Sarco-Endoplasmic Reticulum ATPase pumps (SERCA) due to its over-ubiquitination and its consequent exacerbated degradation by Ubiquitin-Proteasome System (UPS). In the present work, we have characterized SERCA expression in different human in vitro LGMDR1 models observing that CAPN3 dysfunction generates SERCA protein downregulation, leading to increase basal intracellular calcium levels. Moreover, CAPN3-deficient LHCN-M2 human myotubes show upregulated sarcoplasmic reticulum (SR) stress markers. We have targeted SERCA degradation inhibiting UPS by Bortezomib (BTZ) treatment, which recovers not only SERCA2 protein expression but also mutated CAPN3 expression, restoring at least its structural function, and consequently, normalizing resting cytosolic Ca2+ levels. Despite the mild phenotype observed in C3KO mouse model, SERCA protein expression is reduced particularly in the diaphragm, as in C3 null rats, which show slightly more severe phenotype. However, due to the general modest phenotype of LGMDR1 animal models, the narrow therapeutic window between effectiveness and toxicity of BTZ treatment, and the high susceptibility of the rat model to Bortezomib, SERCA protein expression is not restored in the treated animal models. In summary, further studies should focus on using other approaches to stabilize SERCA2 protein in the skeletal muscle, which ideally may also target the maintenance of mutant CAPN3. Furthermore, generation of new animal models with human-like CAPN3 mutations may be needed to analyse preservation of mutant CAPN3. These models would also help understand the different pathophysiological mechanisms underlying this disease and move forward in the search of new therapies.

La familia Kv7 controla la excitación celular en diferentes tejidos, por lo que es importante investigar su fisiología y fisiopatología. Se relaciona con enfermedades como la epilepsia, encefalopatías, arritmias, diabetes y sordera, entre otras. Todos los miembros de la familia Kv7 muestran una estructura muy similar en relación con la función. Esta homología hace que los avances en la investigación de un miembro Kv7 puedan aplicarse generalmente a los demás. La regulación de Kv7.2 es muy compleja. Por un lado, está claro que los senderos de señalización dependen de muchas variables, como los receptores acoplados a la proteína Gq/11 pueden producir una inhibición diferente por la compartimentalización y colocación espacial de las zonas de señalización. Por otra parte, pequeñas moléculas, como el PIP2 y el Ca2+, pueden modular la corriente. Además hay otras proteínas imprescindibles para la función adecuada de Kv7.2: la CaM, encargada de la señalización del calcio y el transporte del canal; la ancarnina, que gestiona la localización neuronal; y la sintaxina, proteína que puede aumentar la síntesis de los canales Kv7 o reducir la degradación/renovación. Esta tesis está enfocada en entender como el calcio afecta en la estabilidad y la dinámica de los canales Kv7, empleando técnicas biofísicas como FRET, RMN, HS-AFM y Dicroismo circular. Hemos comprobado que el cambio conformacional previamente descrito para el monómero del canal se mantiene también en el tetrámero. Además, se observa que el calcio aumenta la estabilidad del canal. En cuanto a la señalización por calcio se demuestra que el linker dentre las hélices A y B del canal desempeña un papel en la transducción de señal de Ca2+. La longitud y la composición del enlazador favorecen los cambios conformacionales en función de Ca2+. Se demuestra también que la calmodulina confiere sensibilidad al calcio a la estabilidad del dominio de ensamblaje de la hélice D intracelular distal de los canales Kv7.2. La formación de ensamblajes tetraméricos dependientes de la hélice distal D influye en la unión de CaM y en las propiedades Kv7.2 dependientes de CaM. Recíprocamente, CaM y Ca2+ influyen en el comportamiento dinámico de la bobina helicoidal D helicoidal. Además, se comprueba que en ausencia de actividad metabólica, la calmodulina permanece unida de manera estable a las hélices A y B dentro de la CRD (calcium regulation domain) durante al menos 30 minutos. Se demuestra que Los cambios conformacionales impulsados por Ca2+ en el dominio sensible al calcio (CRD) de los canales Kv7.2 implican una rotación del lóbulo C de CaM y una separación de las hélices A y B. La influencia La tetramerización dependiente de la hélice D no influye en dicho cambio. Este cambio conformacional se canaliza por la interacción directa de este catión con la mano E-F (3), mientras que la unión de Ca2+ a la E-F (4) tiene una influencia pequeña, pero significativa. Por último, se demuestra que el conector S2/S3 de los Kv7 interactúa con el lóbulo C de CaM en solución, principalmente a través de la mano E-F (3) e invierten los cambios conformacionales dependientes de Ca2+ en el CRD. (

Las moléculas CD300 se expresan en la superficie de células del sistema inmunitario. Estos receptores modulan numerosos procesos inmunológicos y se ha descrito que tienen un papel importante en la inmunopatogenia de distintas enfermedades, incluyendo infecciones virales. El objetivo principal de este trabajo ha sido investigar la expresión, regulación de la expresión y función de los receptores CD300 en distintas células inmunitarias de individuos sanos, y estudiar cómo esto se altera durante la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1. En esta tesis doctoral, observamos que el patrón de expresión de los receptores CD300 es distinto entre poblaciones y subpoblaciones de células inmunitarias, así como entre adultos y recién nacidos. Además, describimos que la activación de los monocitos mediada por CD300c y CD300e es menor en recién nacidos que en adultos. En el contexto de la infección por VIH-1, en primer lugar observamos que la expresión de las moléculas CD300e y CD300f en monocitos de pacientes infectados por VIH-1 bajo cART se asocia con el número de linfocitos T CD4+ y una mayor producción de TNF en respuesta al LPS, pero no en pacientes vacunados con la vacuna frente al VIH-1 MVA-B. También descubrimos que la expresión del receptor CD300a está alterada en las células NK CD56neg en pacientes infectados por VIH-1 no tratados y que este receptor inhibe la degranulación y la producción de citoquinas mediada a través del receptor CD16 en células NK de pacientes infectados por VIH-1. Después, observamos que la expresión del receptor CD300a está alterada también en linfocitos T CD4+ de pacientes infectados por VIH-1 y que su expresión se asocia con marcadores de progresión de la enfermedad. Por último, demostramos que el CD300a identifica una población de linfocitos T CD4+CD45RA- con una mayor susceptibilidad a la infección por VIH-1.

En este trabajo se han analizado muestras correspondientes a un experimento de vacunación de larga duración. Múltiples ovejas fueron expuestas a varias vacunas compuestas de aluminio hidróxido como adyuvante en un periodo de 475 días, con el objetivo de estudiar el mecanismo de acción de dicho adyuvante en el sistema inmune y comprobar si es capaz de llegar a órganos distantes como el cerebro después de su inoculación. Para ello se extrajeron muestras de células mononucleares de sangre periférica y de la corteza del lóbulo parietal y se usaron para la preparación de librerías de secuenciación de ARN y microRNAs (Total RNA-seq y miRNA-seq). Las librerías se analizaron mediante herramientas bioinformáticas y se realizaron multiples análisis: 1. Expresión diferencial tanto para los datos de RNA-seq como para los de miRNA-seq; 2. Anotación de nuevos miRNAs en oveja; 3. Predicción de targets para los miRNAs y análisis de co-expresión con los datos de RNA-seq. Además, como las librerías de Total RNA-seq retienen el ARN no codificante, que esta pobremente anotado en oveja, dichos datos se usaron para la anotación de ARN circulares en oveja y se estudió si dichos ARN no-codificantes pudieran tener algún rol en la actividad del aluminio como adyuvante.

La presente tesis doctoral trata sobre la modulación del metabolismo para el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). Esta patología se caracteriza por una acumulación de grasa en el hígado que da lugar a complicaciones derivadas como la muerte celular, la inflamación, hinchamientoo y desarrollo de fibrosis. Para identificar las dianas terapéuticas presentadas nos hemos centrado en perturbaciones descritas en el transcurso de la EHNA o patologías más severas: el metabolismo del amonio y nitrógeno y la homeostasis de magnesio. En base a ello hemos identificado la glutaminasa 1 (GLS1) y la ciclina M4 (CNNM4) como dianas potenciales a la hora de tratar la enfermedad. Se ha caracterizado una sobre-expresión de ambas proteínas en muestras de pacientes diagnosticados de EHNA, así como en modelos animales de ratón de la enfermedad. Se han realizado estudios pre-clínicos en los que se ha inducido la patología por dos dietas distintas y se ha silenciado específicamente la proteína mediante inyección por vena de la cola, inhibiendo así la expresión del enzima en el hígado. En ambos ensayos pre-clínicos se ha observado una menor acumulación de lípidos intrahepáticos y una disminución del estrés oxidativo derivado. Además, a la hora de elucidar el mecanismo de acción mediante el cual la acumulación de grasa o esteatosis es reducida, se ha identificado que el silenciamiento específico de Gls1 y Cnnm4 promueve la secreción de lípidos en forma de partículas de muy baja densidad (VLDL).

Aging is a universal, complex and heterogeneous process. In the last decades, an overall improvement in the quality of life and consequent increase in life expectancy has been achieved. In contrast, the disability-free life expectancy is not rising. Therefore, research on the biology of aging is essential to prolong healthy aging. In this work, we performed different approaches, focusing on the biomarkers of frailty, extracellular vesicles, inflammaging and immunosenescence. Regarding the biomarkers of frailty syndrome, we propose the elevated expression of EGR1 as a potential candidate. In the case of EVs from plasma, we found that they enhance cell differentiation in osteogenesis and myogenesis, and that they boost T cell activation under immunogenic stimulation, while these effects of EVs are reduced with aging. We also reported the presence of inflammaging and immunosenescence with increasing age, but nonagenarians and centenarians showed reduced senescence in CD4 T cells. Finally, our experiments in multiple sclerosis patients indicate that despite being in remission and under immunomodulatory treatment they have chronic inflammation, and further investigations are needed to evaluate the possible incidence of premature aging in this and other autoimmune diseases.

Los tumores cerebrales, como el glioblastoma (GBM) en adultos y el meduloblastoma (MB) en niños, representan uno de los retos más importantes de la medicina actual, ya que resisten a las terapias disponibles, recurren y se diseminan. Dichos tumores presentan una alta heterogeneidad, ya que albergan una subpoblación de células madre tumorales (CSCs), responsables de la metástasis, resistencia a tratamientos y recurrencia tumoral. Además, la desregulación de aquellos genes relacionados con el desarrollo embrionario y el mantenimiento de las células madre, como ERBB4 y SOX1, parece ser crítica para el desarrollo y la progresión del fenotipo canceroso. La presente tesis doctoral tiene como objetivo principal determinar la función de ambos genes en el GBM y el MB, así como establecer su relación con las CSCs específicas de cada tumor (GSCs y MBSCs, respectivamente). En primer lugar, observamos que ERBB4 tiene una función esencial en el desarrollo del cerebelo, controlando la población de las células progenitoras y su proceso de migración. Además, determinamos que ERBB4 se encuentra altamente expresado en los MBs del Grupo 4 y SOX1 en los del Grupo SHH, asociándose en ambos casos a una peor supervivencia. Al inhibir la expresión de ERBB4 y SOX1, observamos una reducción de la viabilidad celular, capacidad de autorrenovación, y de iniciación y progresión tumoral. Asimismo, identificamos un enriquecimiento de la expresión de SOX1 y ERBB4 en las MBSCs. También establecimos una relación entre la elevada expresión de SOX1 y una peor supervivencia en GBM, además del enriquecimiento de su expresión en las GSCs. Por último, al inhibir la expresión de SOX1 en GBM, observamos una disminución de la capacidad de proliferación, iniciación y progresión tumoral. En conjunto, nuestros resultados sugieren un papel oncogénico hasta ahora no descrito de ERBB4 y SOX1 en MB y GBM. Además, este trabajo propone la inhibición de ERBB4 y SOX1 como una estrategia terapéutica prometedora para atacar las CSCs y así combatir la resistencia a las terapias.

Adaptation to hypoxia is a puzzling and tightly regulated challenge. This adaptability involves a severe gene expression rewiring, which is mainly triggered by the Hypoxia Inducible transcription Factor (HIF). Canonically, the regulation of the hypoxia signalling pathway mostly relies on HIF-¿ subunit, which has been described to be exquisitely regulated through the Ubiquitin Proteasome System (UPS). Because of the Ub conjugation¿ crucial role in the hypoxia pathway and in light with DUBs being druggable enzymes, we carried out an unbiased loss-of function screen to identify new DUBs modulating HIF signalling. Using this strategy, we identified 12 novel hypoxia-related DUBs. In this project, we have validated the hit candidates and further focused on USP11 characterization. We have shown that USP11 is required to sustain hypoxia-driven signalling. Indeed, USP11 binds the mRNA-binding protein, hnRNPD, forming a ribonucleoprotein complex that controls HIF1A mRNA turnover by hnRNPD-mediated interaction with HIF1A 3¿UTR. Consistent with the decrease in HIF1A mRNA upon hypoxia, we have shown that hypoxia inhibits USP11 activity and promotes hnRNPD/p37 nuclear accumulation. Therefore, USP11-mediated HIF1A post-transcriptional regulation reveals a new mechanism to fine tune HIF signalling and hypoxia adaptation, and might represent a new opportunity to understand the pathology of Lyme disease.

El tamoxifeno, un antagonista del receptor de estrógeno (ER), es el fármaco más utilizado en pacientes con cáncer de mama ER-positivo. Sin embargo, el 30% de los casos desarrollan resistencia. Nuestro laboratorio ha demostrado que el aumento del contenido de células madre cancerosas (CSCs) es mediado por el incremento de la expresión del factor de transcripción Sox2 durante el desarrollo de resistencia al tamoxifeno. En esta tesis, examinamos el potencial efecto inhibidor de los polioxometalatos (POMs) sobre Sox2 en células resistentes al tamoxifeno. En primer lugar, demostramos que diferentes POMs bloquean la actividad de unión al ADN de Sox2 in vitro. El derivado K6[P2W18O62] (PW) es el POM más eficaz en la inhibición del crecimiento celular induciendo una parada de ciclo celular y la muerte por apoptosis. Además, mostramos que PW bloquea específicamente la regulación del marcador de la transición epitelio-mesénquima (EMT) SNAI2 mediada por Sox2, que inhibe las capacidades de migración e invasión de células resistentes al tamoxifeno. Además, los ensayos in vivo en la membrana corioalantoidea de embriones de pollo confirman que la inhibición de Sox2 mediada por PW reduce el contenido de la población de CSCs y restaura la sensibilidad al tamoxifeno. Molecularmente, la correlación inversa entre los niveles de expresión de Sox2 y ER se revierte con el tratamiento de PW en células resistentes al tamoxifeno. La regulación directa de Sox2 sobre el promotor del gen de ER se ve afectada por el tratamiento con PW, lo que conlleva a la activación parcial de la vía de señalización de ER y la restauración de la sensibilidad al tamoxifeno. Finalmente, la relevancia terapéutica de atacar a las CSCs dependientes de Sox2 destaca el potencial uso clínico del derivado K6[P2W18O62] como inhibidor de Sox2 para tratar un subconjunto específico de pacientes con cáncer de mama resistente al tamoxifeno.

This research employs state-of-the-art methodologies in biochemistry and NMR structural biology to uncover the molecular complexities governing the actions of SecA and TF as they guide the NCs towards their 3-Dimensional fold. Employing the NMR SOFAST technique and using the Methyl TROSY approach, I have elucidated the dynamic interactions between SecA, TF, and diverse types and lengths of nascent chain ribosome complexes (RNCs), including those destined to the outer membrane (e.g., OmpA85, OmpA192, OmpA192ms), the cytosol (DHFR), or the inner membrane (PhoA). Our findings reveal that the conformation of SecA changes while interacting with the ribosome, significantly influenced by the presence of the NC, supporting a growing body of evidence (Huber et al., 2017; Wang et al., 2019; Z. Zhu, Wang, & Shan, 2022) that SecA participates in co-translational protein folding. Specifically, according to our results, SecA behaves differently depending on the size and type of the NC being synthesized, establishing stronger interactions with the longer RNCs. Notably, our observations also underscore the pivotal role of domains NBD-1 and NBD-2 in the SecA-RNC interactions, in agreement with the recent structural and biochemical studies (Huber et al., 2017; Knüpffer et al., 2019; Wang et al., 2019). Additional changes are observed in the PBD and HWD domains of SecA, explained by the well-documented domain rearrangements of the PBD, switching between the open and closed conformation (Vandenberk et al., 2019; Zimmer & Rapoport, 2009). We also demonstrate, for the first time, to the best of our knowledge, an interaction between the CTT of SecA and TF. Furthermore, the addition of TF to the SecA-RNC complex results in a concentration-dependent increase in SecA peak intensities, along with significant chemical shift perturbations (CSPs) primarily for the longer RNCs, indicating that TF can modulate the interaction between SecA and the RNC. Overall, these findings provide valuable insights into the conformational dynamics of the SecA co-translational protein targeting pathway in response to TF.

La enfermedad del hígado graso no alcohólica, EHGNA o NAFLD, es la causa más frecuente en el mundo de enfermedad crónica hepática. Su desarrollo se ha asociado en algunos casos a un metabolismo errático de S-Adenosilmetionina (SAMe). SAMe es una molécula donadora de metilos que participa en múltiples procesos celulares. En éste trabajo demostramos que el exceso hepático de SAMe, a través de la vía PEMT, de la que es sustrato, es capaz de inducir el acúmulo de triglicérido en el hígado al mismo tiempo que induce la secreción de éste al torrente circulatorio en forma de VLDLs. Además, las VLDLs que se secretan en el contexto de elevados niveles de SAMe presentan unas características específicas que contribuyen a que su aclaramiento del plasma sanguíneo sea mayor. Las características y la secreción hepática de VLDL no sólo se ve afectada en contextos con elevado SAMe, sino también cuando los niveles de SAMe son bajos. SAMe es por tanto capaz de modular el metabolismo lipídico hepático al mismo tiempo que el metabolismo sistémico de VLDL.

Osteopontin deficiency protects from obesity-related hepatosteatosis and liver fibrosis. Here we have investigated the role of osteopontin as a direct regulator of liver metabolism and whether osteopontin could be a serum-biomarker of liver metabolic dysfunction in non-alcoholic fatty-liver (NAFL) disease patients. We demonstrate that osteopontin regulates the crosstalk between liver cholesterol and phosphatidylcholine metabolism, being the key process the conversion of cholesterol into bile acids, frequently decreased in NAFL. In osteopontin-deficient mice enhanced cholesterogenesis in hepatocytes leads to decreased de novo lipogenesis and in vivo inhibition of cholesterogenesis normalizes liver phosphatidylcholine content. Finally, serum osteopontin levels correlate with liver phosphatidylcholine and cholesterol concentration in non-obese NAFL patients, in whom adipose tissue metabolic deregulation is not evident and conversion of cholesterol into bile acids is decreased. In conclusion, osteopontin is a key regulator of liver lipid metabolism and may be an early serum-biomarker of metabolic deregulation in non-obese NAFL patients.

Los gliomas son el tumor primario cerebral más común. Se subdividen en 4 grupos según su malignidad. Dentro de estos, el GBM es el más frecuente, el más maligno y se destaca por su agresividad y resistencia al tratamiento. La mediana de supervivencia es de 14 meses del diagnóstico y menos de un 5% sobrevive 5 años. La mediana de supervivencia es de 14 meses del diagnóstico y menos de un 5% sobrevive 5 años. El avance en las técnicas de investigación sobre el genoma, transcriptoma y proteoma del GBM, ofrecen la oportunidad de comprender el proceso de la glioma-génesis como condición necesaria para diseñar estrategias terapéuticas racionales. En este proceso onco-genético están implicados un conjunto de anomalías genéticas relacionadas con la diferenciación, el control de la proliferación, del crecimiento, de la muerte y del ciclo celular. La incorporación de métodos complementarios de diagnóstico, el refinamiento de la técnica quirúrgica, el cuidado postoperatorio, han conseguido acortar el tiempo entre el primer síntoma y el diagnóstico y disminuir la morbi-mortalidad peri-operatoria mejorando la calidad de vida de los enfermos. Sin embargo, el pronóstico de los pacientes no ha variado. El GBM es resistente al tratamiento en virtud de sus características biológicas que pueden ser comprendidas desde el punto de vista tisular, celular y molecular. Sin embargo, el mecanismo molecular exacto del GBM permanece aún desconocido. Los ARN no codificantes de cadena larga (LncRNAs, del inglés long non coding RNA) han surgido recientemente como reguladores en procesos fisiológicos y patológicos. Distintos estudios, indican que la expresión aberrante de algunos LncRNAs puede jugar un papel en la patogénesis del GBM y que podrían estar asociados con su pronóstico. En este trabajo, caracterizamos la expresión de un patrón de LncRNAs, previamente descrito como supresor tumoral en cáncer colorectal. Se ha analizado su expresión en muestras de glioma de bajo y alto grado observando que su expresión era elevada en muestras de glioma de bajo grado y se reducía en los de alto grado, siendo los menores en la cohorte de GBM. Además, se estratificaron los GBMs en base a la expresión de los LncRNAs en altos y bajos, presentando estos últimos menor supervivencia de los pacientes, aunque no se encontró correlación estadísticamente significativa. A nivel fisiológico, los LncRNAs correlacionaron con la localización frontal, temporal y en zona elocuente, mientras que a nivel molecular se identificó una correlación inversa con los genes SOX1, SOX2 y SOX9, genes cuyos niveles elevados se han correlacionado anteriormente con menor supervivencia y peor pronóstico. Además, mediante ensayos funcionales hemos revelado el importante papel que desarrollan estos LncRNAs en relevantes procesos fisiopatológicos como la proliferación celular y la auto-renovación lo que confirma este patrón de LncRNAs como posibles dianas terapéuticas en este tipo de cáncer. Nuestro trabajo ha demostrado que algunos LncRNAs se expresan diferencialmente en el GBM, cuando se compara con el tejido cerebral normal y con tejido de glioma de bajo grado, y que, la reducción de su expresión se asocia a la progresión y malignización de los gliomas. En general, estos resultados subrayan el impacto que estos LncRNAs podrían tener como marcador diagnóstico en el GBM.

The current state-of-the-art of biotechnology has improved tremendously over the last decades. Currently, the physico-chemical properties can be manipulated at molecular scale. Bottom-up design of complex functional nanostructures is of the great interest because it allows the synthesis of ordered structures using the intrinsic self-assembly properties of simple components. In this sense, repeat proteins are useful tools for this task due to their modular and hierarchical structure, which can be the basis to construct complex supramolecular assemblies. In this thesis, repeat proteins and in particular consensus tetratricopeptide repeat proteins (CTPR) have been employed to generate higher order structures and to design and fabricate functional materials. CTPR proteins belong to the large family of repeat proteins and consist of a 34 amino acids helix-turn-helix domain. CTPR repeats can be combined in tandem to form superhelical arrays, in which eight repeats comprise one full turn of the superhelix. On the one hand, in this thesis we describe an experimental approach to form higher order architectures by a bottom-up assembly of CTPR building blocks. Introducing a novel interface along the CTPR superhelix allows two CTPR molecules to assemble into protein nanotubes. We designed two models to form protein nanotubes based on electrostatic interactions and on ¿-¿ interactions. These studies provide insights into the design of novel protein interfaces for the control of the assembly into more complex structures, which will open the door to the rational design of nanostructures and ordered materials for many potential applications in nanotechnology. On the other hand, we generate functional films based on repeated proteins with applicability in different fields such as optics and energy production. In particular, we show the formation of nanopatterned protein films labeled with fluorescent dyes to produce Amplified Spontaneous Emission (ASE) and Distributed Feedback (DFB) lasing relevant for sensing. In parallel, protein films are used to entrap active enzymes, without apparent loss of activity. This film is used to generate energy through the catalase enzymatic activity by coupling the film to a piezoelectric device sensitive to the pressure changes of the produced oxygen.

Viruses are parasitic biological agents that in the virion state contain different morphologies and assembly organisations. In some virions, a lipid membrane of cellular origin is a structural component of the infectious particle. This membrane can be located as the outermost layer or internally depending on the species. Our work aims at understanding the mechanism of assembly and the viral proteins involved in cellular infection, using for that Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) and Cryo-electron tomography (Cryo-ET). In the first case, we present the 3D structures of the archaeal, halophilic, internal membrane-containing Haloarcula californiae icosahedral virus 1 (HCIV-1) and Haloarcula hispanica icosahedral virus 2 (HHIV-2) at 3.7 and 3.8 Å resolution, respectively, using single-particle cryo-electron microscopy. These structures reveal the viral assembly mechanisms of the capsid shell over the internal membrane and the morphology of the viral receptors. In the second case (ongoing study), using Cryo-ET technique, we have morphologically characterised pleomorphic Bovine Viral Diarrhea Virus 1 (BVDV), as very little is known about the assembly, virus entry and antibody recognition. Thus, combining cryo- ET with sub-tomogram averaging, we present the preliminary cryo-ET average map of the BVDV type 1 bound to mAbs against the glycoproteins Erns.

La protección del genoma viral durante el viaje extracelular es un requisito absoluto para la supervivencia y replicación del virus. Una vez que la partícula viral se une a la célula huésped, puede comenzar la eyección del material genómico. Además de las cápsides proteicas casi universales, ciertos virus poseen una capa de membrana que encierra su genoma de ADN bicatenario (ds) dentro de la cubierta proteica. Aunque las propiedades mecánicas de otros virus se han estudiado anteriormente, esta tesis investiga un virus con una membrana bajo su cápside proteica. Usando el virus enterobacterial PRD1 como prototipo de virus sin cola que contienen membrana, y una combinación de ensayos de nanoindentación mediante la microscopía de fuerza atómica y modelado de elementos finitos, mostramos que la arquitectura jerárquica de PRD1 (cubierta de proteína, vesícula proteolipidica, ds ADN) proporciona una mayor estabilidad contra el estrés mecánico que la lograda por otros virus icosaédricos ds ADN que carecen de una membrana. La combinación de un caparazón proteínico rígido y quebradizo junto con una vesícula de membrana blanda y dócil produce un nanomaterial compuesto resistente adecuado para proteger el ADN viral durante el transporte extracelular. Además, observamos la estructura y las propiedades mecánicas que implican el ensamblaje del tubo de eyección de ADN de dicho virus. Si bien los estudios han resuelto la estructura de varios virus en tubos, aquí investigamos un fago que forma el tubo de eyección de ADN al unirse. Empleamos la reconstrucción con crio-microscopía electrónica (cryo-EM) para mostrar que esta partícula viral está produciendo un tubo estructurado, no helicoidal, con una simetría axial de siete veces, que se forma utilizando la membrana proteolípica. En combinación con ensayos de nanoindentación de microscopía de fuerza atómica (AFM), visualizamos partículas individuales que producen tubos y mostramos que el tubo de PRD1 tiene una rigidez comparable a estructuras tubulares similares, como túbulos lipídicos gruesos o virus del mosaico del tabaco (TMV). Hay sugerencias sobre la capacidad del tubo de autocurarse, cuando se libera presión mecánica externa después de la compresión más allá del punto de fluencia. Estos resultados proporcionan la primera comprensión de la relación entre la estructura, las propiedades mecánicas y la función de los virus que contienen membrana. Podrían beneficiar a los nanoingenieros que podrían incorporar el diseño compuesto de PRD1 en su búsqueda de nanopartículas más estables, pero también la búsqueda de nuevas soluciones farmacéuticas que se ocupen de la resistencia antibacteriana y las infecciones bacterianas en general, ya que este nanotubo proteolipídico puede perforar agujeros en la pared celular bacteriana. El trabajo presentado en esta tesis implica el bacteriófago sin tubo PRD1, un virus con una membrana lipídica debajo de su capa proteica. Aquí se abordan cuestiones relacionadas con la estabilidad mecánica de la partícula, junto con las contribuciones de cada uno de sus componentes arquitectónicos. También arrojamos luz sobre el ensamblaje, la estructura y las características del tubo de eyección de ADN proteolipídico; esta información sin precedentes podría proporcionar nuevas estrategias sobre el diseño de nuevos antimicrobianos y nanopartículas. Esta tesis tiene los siguientes objetivos generales: ¿ La investigación mecánica mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) del bacteriófago PRD1 que contiene lípidos mediante el análisis de cada componente arquitectónico utilizando partículas derivadas de PRD1. ¿ La investigación mecánica y estructural del tubo de eyección de ADN de PRD1, utilizado para la infección de células bacterianas, mediante microscopía crioelectrónica (cryo- EM) y AFM. La tesis se estructura de la siguiente manera: El Capítulo 1 es el capítulo introductorio y cubre una descripción general de virus y bacteriófagos, con un enfoque específico en PRD1; así como una descripción general de las dos principales técnicas utilizadas durante el lapso de la tesis: AFM y cryo-EM. El Capítulo 2 cubre los objetivos de este estudio. El Capítulo 3 describe la investigación nanomecánica de los componentes arquitectónicos individuales de PRD1, y dilucida cómo estos contribuyen a la rigidez y la estabilidad mecánica del virión PRD1. El Capítulo 4 estudia la investigación estructural y nanomecánica del tubo de eyección de la cola de PRD1. El Capítulo 5 es el capítulo final que fusiona las principales conclusiones de cada capítulo y brinda una breve perspectiva de lo que esta investigación puede proporcionar a los futuros investigadores. El Capítulo 6 contiene la bibliografía para la tesis completa. El apéndice tiene una lista de todas las abreviaturas presentes en este trabajo, así como una colección de artículos publicados del trabajo que se han realizado en los últimos 4 años. CONCLUSIONES ¿ Los virus se pueden ver como entidades biológicas compuestas donde los ácidos nucleicos, las proteínas y los lípidos se ensamblan para producir partículas funcionales para la infección. Esta tesis ha proporcionado una primera comprensión de las propiedades nanomecánicas de los virus con una membrana interna. Se puede esperar que se convierta en una referencia para el trabajo futuro con esta clase de virus. ¿ Las propiedades nanomecánicas de PRD1 muestran que el genoma presurizado proporciona rigidez, pero no mejora la estabilidad, ya que los mutantes sin genoma ceden bajo la misma fuerza, incluso si son menos rígidos. ¿ Las cápsidas de proteínas Penton-less rinden 3 veces antes que los mutantes libres de genoma, pero que contienen vesículas. ¿ La vesícula proteolípica es de un orden de magnitud menos rígida que cualquier partícula PRD1 investigada, pero se comporta de manera similar a otras vesículas lipídicas. ¿ Proponemos que, como en un material sándwich compuesto, una matriz proteínica / polipéptido interfacial en PRD1 genera una conexión estrecha que acopla mecánicamente la cápside y la membrana. Será interesante ver si el principio de diseño de mejorar la estabilidad mecánica mediante la formación de una doble capa compuesta de cápside-membrana es exclusivo de PRD1 o generalmente empleado para esta clase de virus. ¿ El tubo de eyección de ADN de PRD1 está compuesto de material proteolípido. La polimerización de la proteína formadora de tubos conduce a una serie de discos apilados, cada uno compuesto de siete subunidades, y que tiene una simetría de siete veces, pero no una helicoidal. ¿ Estudios previos de mutación del fago PRD1, junto con nuestros resultados actuales, sugieren que la proteína transmembrana P32 es la proteína polimerizante. ¿ Este enriquecimiento de proteínas durante la remodelación de la membrana conduce a una bicapa de lípidos más delgada y colapsada durante la polimerización del tubo. ¿ Las características nanomecánicas del tubo, además de la presencia de una estructura definida, insinúan la presencia de material proteico, ya que exhibe un carácter más rígido en comparación con la vesícula lipídica sola. PERSPECTIVAS Cuando respondimos algunas preguntas sobre la estructura mecánica y el ensamblaje de la cápside y el tubo de PRD1, también surgen preguntas adicionales. 1. Se debe realizar un trabajo final sobre la estructura del tubo. 2. Queda por validar si otros virus que contienen membrana muestran un comportamiento similar al que muestra PRD1. Esto podría generalizar nuestro modelo propuesto de que la arquitectura multicapa proporciona una mayor estabilidad de partículas. 3. La investigación de mutante P32, que producen tubos más cortos proporcionaría una mayor comprensión en el montaje del nanotubo. En una perspectiva amplia, nuestros resultados pueden ayudar a los nanoingenieros en su búsqueda de nanopartículas más estables, ya que la naturaleza compuesta de PRD1 puede ser una inspiración para el diseño de nanopartículas. Además, la búsqueda de nuevos antimicrobianos podría ser asistida por el uso de máquinas de nanodrilling, como el tubo de eyección del bacteriófago PRD1.

Nowadays, around 60% of the world¿s population dies due to chronic inflammatory conditions, such as chronic respiratory diseases, obesity, fatty liver disease and cancer. All these pathologies are associated to alterations in sphingolipid metabolism. Thus, understanding the mechanisms responsible for the establishment and evolution of those diseases may be useful for developing novel strategies to control their development and progression. In this thesis, we demonstrate that ROCK1 is a key regulatory enzyme necessary for cigarette smoke extract (CSE)-induced monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) release in lung epithelial cells, and that AKT2 and the Ceramide Kinase (CerK)/ ceramide 1-phosphate (C1P) axis elicit the opposite effects, pointing to an anti-inflammatory role of C1P in the lungs. We also provide evidence suggesting that adipogenesis is associated with an increase in phosphatidylethanolamine N-methyltransferase-2 (PEMT-2) protein expression, whose depletion leads to impaired adipocyte differentiation, as seen by a reduced expression of adipogenic markers, as well as reduced lipid droplet formation, triglyceride (TG) content and leptin release. Moreover, we demonstrate that the inhibition of adipocyte differentiation by exogenous C1P occurs by modulating PEMT expression. Besides, we have also found an abnormal sphingolipid metabolism in Pemt-/- mice fed a HFD (a well-known non-alcoholic fatty liver disease mouse model), with elevation of ceramides, sphingomyelin, sphinganine, sphingosine, 1-deoxyceramides, and C26:1 C1P as well as higher expression of mRNAs for acid ceramidase (Asah1) and ceramide kinase (CerK). Treatment with vitamin E (0.5 g/kg) for 3 weeks improved VLDL-TG secretion and normalized cholesterol metabolism, but failed to reduce hepatic TG content. Moreover, vitamin E treatment was able to reduce hepatic oxidative stress, inflammation and fibrosis, and restored Asah1 and CerK mRNA and sphingolipid levels, showing that vitamin E treatment efficiently prevents the progression from simple steatosis to steatohepatitis in mice lacking PEMT, and that sphingolipid metabolites and Asah1 and CerK may be important factors in this action.

Oil Palm (OP) is the crop with the highest oil yield per hectare and as a result, its use has spread rapidly in tropical regions of Asia, Africa and America. The main OP plantations consist of Elaeis guineensis (Eg) species, known to produce high amounts of oil. However, in American regions this species is being affected by the ¿Pudrición de Cogollo¿ disease leading to dead palms. Therefore, OP companies started crossing this species with E. oleifera (Eo) palms which is resistant to this disease. The obtained interspecific hybrids show interesting characteristic inherited from both parents; resistance to different diseases, interesting oil quality characteristics, competitive oil production and decreased height which prolongs its useful life. However, little work has been done in the improvement of these hybrids. This thesis tries to address this gap applying different molecular approaches. First, an extensive study of an amplicon of the ¿Shell-thickness¿ (Sh) gene has been conducted on 568 Eg, Eo and hybrid genotypes. Then, with the aim to discover promising new Candidate Genes (CG) that could be exploited in further molecular assisted selection systems (MAS) a large phenotypic study of 25 production and quality traits have been performed within 198 hybrid genotypes fllowed by two Association Mapping (AM) assays. These latter have been based on targeted CG and random Restriction site associated RNA sequencing (RARSeq) approaches.

La alergia al polen (polinosis) es una de las alergias más comunes que afecta hasta a un 20 % de la población europea, siendo los pólenes de gramíneas los principales causantes de polinosis. Para el tratamiento de la alergia, la inmunoterapia específica con alérgenos es la única terapia modificadora de la enfermedad con efectos clínicos (mejoría de los síntomas) de larga duración. Sin embargo, los efectos secundarios de la administración de extractos alergénicos limitan la aplicación extensiva de este tipo de inmunoterapia. El objetivo de este trabajo ha sido la generación de una novedosa vacuna para tratar la alergia al polen de gramíneas, a través del desarrollo de una inmunoterapia de segunda generación basada en proteínas recombinantes mediante la estrategia de híbridos hipoalergénicos. En el trabajo se describen las etapas para llevar una idea de laboratorio de investigación a un producto potencialmente industrializable aplicando el concepto de calidad mediante diseño. La inmunoterapia basada en principios activos puros y debidamente caracterizados, permitirá una práctica clínica más segura y eficaz.

Los procesos de remodelación de membranas, especialmente aquellos en los que la transformación supone un proceso irreversible, como son la fusión y la fisión, son mecanismos vitales de las células eucariotas para su correcto funcionamiento, tanto a nivel interno, como entre el medio extracelular y el intracelular. Para poder realizarse tales procesos, las maquinarias moleculares (complejos proteicos) se encargan de interactuar con las membranas diana mediante distintos mecanismos (proteínas citosólicas), o bien forman parte de la propia membrana mediante largos dominios hidrofóbicos actuando como anclas. En ambos casos, tales proteínas tienden a oligomerizar para poder formar complejos funcionales a la hora de generar la energía necesaria para ser capaces de llevar a cabo procesos de fisión y fusión. En esta tesis doctoral, me he centrado en el estudio de dos proteínas encargadas de la remodelación de la membrana, la Dinamina 2 (citosólica) y el Reticulon (transmembrana). En ambos casos, hemos descubierto como las características físico-químicas, así como la geometría de las membranas que serán remodeladas, son de vital importancia para la transición de estas proteínas a complejos funcionalmente activos en la fisión de las membranas. Así pues, el presente trabajo revela como las membranas diana juegan un papel clave en la activación de la actividad remodeladora de complejos proteicos específicos

E2F7 forma parte de la familia de factores de transcripción E2F y al igual que el resto de miembros de la familia, juega un papel crítico en la regulación del ciclo celular. Mientras que los mecanismos a través de los cuales los miembros E2F1-6 llevan a cabo la regulación transcripcional se conocen relativamente bien, habiendo identificado los principales complejos proteicos implicados en sus funciones activadoras o represoras, los mecanismos mediante los cuales E2F7 actúa como represor transcripcional para contrarrestar la activación transcripcional de los genes diana de E2F1-3 durante la progresión celular a través de la fase S, sigue sin caracterizarse completamente. Este trabajo de tesis se ha centrado en la investigación de los posibles interactores de E2F7, participes de la maquinaria represora empleada por E2F7. Se presentan evidencias de la interacción directa entre E2F7 y WDR5, una proteína conocida por ser crítica para la estabilidad y la actividad enzimática de los complejos de metilación de la cromatina MLL/SET implicados en la activación transcripcional. Además, los estudios funcionales llevados a cabo muestran un papel modulador de WDR5 sobre la actividad represora de E2F7. De hecho, el análisis de secuenciación masiva de ARN predice la implicación de dicha interacción en procesos de regulación transcripcional. Este análisis también ha permitido la identificación de genes diana de E2F7 no identificados hasta la fecha y regulados por el eje E2F7-WDR5.

Metagenomics has revolutionized the agricultural microbial ecology. In particular, the adoption of such technique in viticulture dates back to 10 years, where the microbial diversity and composition of grapevine and wine environment have been studied. The aim of this study is to characterize the bacterial diversity and composition of the soil and H. zuri grape variety all over the 3 Designation of Origin of txakoli in the Basque Country, using highthroughput sequencing. This research shows that soil and grape bacteriome differs significantly among vineyards, but no DO-specific bacterial profile was identified, suggesting that the Txakoli viticultural region of the Basque Country represents a single bacterial terroir. Yeast and fungal studies that track microorganisms in the field, cellar and in winemaking processes are needed to unravel whether the final wine has a microbial terroir and at what step differentiation begins. Soil samples bacterial communities are driven by pH, while grape bacteriome is influenced by rootstock genotype. Interestingly both soil and grape microbiota were shown to be affected by distance from the sea or the influence of sea breeze. Further analyses should be conducted to gain more knowledge on the influence of microclimatic factors on grape microbial ecology, so that wine growers can use this information to improve grape quality and wine characteristics.

Diagnosing porphyria presents challenges due to its nonspecific clinical manifestations, necessitating diverse biochemical analyses. This study introduces an enzymatic approach aimed at elucidating the underlying molecular mechanisms of porphyria and identifying specific intermediates responsible for enzyme inhibition. Through metabolite screening and biophysical experiments, it provides insights into enzyme inhibition patterns crucial for diagnosing and managing acute attacks. Furthermore, the study explores abnormal porphyrin profiles in COVID-19 patients, indicating potential disruptions in the heme pathway and offering valuable insights into hematological disorders associated with severe COVID-19.

La colitis ulcerosa (CU) es un trastorno inflamatorio crónico que afecta al intestino. Aunque la causa es desconocida, es una enfermedad multifactorial que está desencadenada por el sistema inmune, factores medioambientales, variaciones genéticas y comunidad microbiana. En trabajos recientes se ha relacionado la disfunción mitocondrial con la EII. Además, se ha descrito que existe una interacción bidireccional entre las mitocondrias y la microbiota, que parece jugar un papel clave en la enfermedad. Por todo ello, con el fin de reducir la heterogeneidad clínica de los pacientes en este trabajo, hemos utilizado un modelo de ratón deficiente en MCJ (Methylation-controlled J protein), una proteína localizada en la membrana interna de la mitocondria que actúa como un regulador negativo del complejo I de la cadena respiratoria, para estudiar el papel de la disfunción mitocondrial dentro de la CU. La inducción de una colitis aguda en ratones deficientes en MCJ resultó en un fenotipo de enfermedad más grave, como consecuencia de la disfunción mitocondrial y una modificación de la composición microbiana. De hecho, se observó un aumento de la presencia de Ruminococcus gnavus, una especie comúnmente incrementada en la microbiota intestinal de pacientes con EII. Los ratones deficientes en MCJ mostraron en el colon una sobre expresión de Timp3, lo cual condujo a la inhibición de la actividad de TACE que es la enzima encargada de la liberación del Tnf unido a la membrana celular, confirmando los hallazgos descritos previamente en macrófagos derivados de médula ósea. Además, los análisis de expresión génica en pacientes que sufren CU también mostraron niveles reducidos de MCJ y una mayor expresión de TIMP3 en el colon. Nuestros resultados también implican los receptores Fc¿R de los macrófagos intestinales en la patogénesis de la CU y en el fallo a la respuesta a terapias biológicas a causa de la disfunción mitocondrial. Finalmente, la inducción de la colitis crónica demostró que el tejido del colon es capaz de adaptarse de una manera dinámica a los cambios del entorno adaptándose metabólicamente a las nuevas condiciones, desapareciendo el aumento de severidad por la falta de MCJ. En resumen, los datos obtenidos posibilitan el establecimiento de nuevas líneas de investigación para predecir en estadios tempranos la evolución de la enfermedad y la respuesta a la terapia con agentes anti-TNF en pacientes con CU. Por otra parte, este estudio nos ha permitido identificar posibles firmas microbianas en las heces asociadas con la progresión de la enfermedad y la respuesta a terapias, que podrían servir como biomarcadores predictivos, permitiendo la estratificación de los pacientes.

CRM1 bestelako ehunka proteinaren, kargoren, nukleotik zitoplasmaranzko garraioa egikaritzen duen hartzailea da. Horretarako, CRM1ek poltsiko hidrofobiko bat du, zeinetara kargoen esportazio seinaleak, NESak, lotzen diren. Tesi honetan, hainbat kargo edota NES berri identifikatu eta baieztatu dira, horien artean, lehenengoz aktiboki garraiatzen den mikropeptido bat eta horren NESa identifikatu dira. Gainera CRM1 eta NESen arteko lotura testu inguru zelularrean sakontasunean aztertzeko esportazio entsegu berri bat garatu da, zeinak lotura horretan parte hartzen duen aminoazido bakoitzaren zeresana aztertzeko bidea eman duen. Bestetik, CRM1en kargo asko minbiziarekin erlazionatuta, beraz, ez da harritzekoa CRM1 minbiziarekin estuki erlazionaturik egotea. CRM1 minbizian gainadierazita zein mutaturik aurkitu da, eta jada, CRM1 inhibitzaile den selinexor minbizia jakin batzuen tratamendurako onartua izan da. Tesi honetan, CRM1en mutazio onkogenikoak NESen esportazioan duen eragina aztertu da, gainera, selinexor eta beste ituratutako farmakoen arteko sinergia posibleak bilatu dira AML zelulak erabiltzen dituen sistema modelo batean. Eta bukatzeko, CRM1en inhibitzaileek proteoma mailan duten eragina aztertzea ahalbidetuko duen proteinen gertuko biotinilazioan oinarritutako estrategia berri bat garatu da.

La leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es la neoplasia más frecuente en la población pediátrica. La supervivencia global de la LLA supera hoy día el 80%, en parte gracias a la intensificación del tratamiento. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes del tratamiento son las toxicidades que presentan algunos individuos y que pueden conllevar a una reducción/omisión de dosis, con el consiguiente impacto negativo en el pronóstico. Por ello, es de interés la búsqueda de marcadores que predigan dicha toxicidad. En los últimos años, se han obtenido resultados interesantes que relacionan la toxicidad farmacológica con polimorfismos de un únivo nucleótido (SNP) en genes de las rutas farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD). Es conocido que estos genes son regulados postranscripcionalmente por los microRNAs (miRNAS) y que SNPs en miRNA pueden conllevar cambios en los niveles de expresión o su función. Por ello podríamos esperar que estos SNPs, pudieran afectar la regulación de los genes PK/PD y en consecuencia al desarrollo de las toxicidades. El objetivo de esta tesis es la identificación de nuevos marcadores genéticos en miRNAs, predictores de toxicidad del tratamiento, en un grupo de pacientes pediátricos con diagnóstico de LLA-B homogéneamente tratados dentro del protocolo LAL/SHOP. Se han identificado un total de 8 marcadores candidatos de predicción de toxicidades como: neurotoxicidad periférica inducida por VCR, hipertransaminasemia inducida por metotrexato, mucositis, diarrea, vómitos y niveles plasmáticos elevado de metotrexato.

Los glicolípidos desempeñan un papel central en una variedad de procesos biológicos importantes en todos los organismos vivos. PatA es una aciltransferasa asociada a la membrana implicada en la biosíntesis de fosfatidil-mio-inositol manósidos (PIMs), elementos estructurales clave y factores de virulencia de Mycobacterium tuberculosis. PatA cataliza la transferencia de un grupo de palmitoilo desde palmitoil-CoA a la posición 6 del anillo de manosa ligado a la posición 2 del inositol en PIM1/PIM2. Este estudio describe una investigación detallada de la estructura tridimensional, el sitio de unión al glicolípido aceptor y el sitio de union al sustrato acilo dador, así como también el mecanismo catalítico de PatA de M. smegmatis. Usando cristalografía de rayos X, técnicas bioquímicas y biofísicas, metadinámica de cuántica-mecánica/molecular-mecánica (QM/MM) y síntesis química, se propone un modelo para el reconocimiento de sustrato, la catálisis y la inhibición de la enzima. También se discuten las implicaciones de este modelo en la comprensión de los primeros pasos de la biosíntesis de los PIMs y el modo de acción de otros miembros de la familia de enzimas aciltransferasas bacterianas.

La autofagia es una vía de degradación conservada entre los eucariotas caracterizada por la formación de una vesícula de doble membrana (autofagosoma) alrededor de lo que se quiere degradar para su posterior eliminación en el lisosoma. Hay un gran número de proteínas implicadas, entre ellas encontramos dos sistemas tipo ubiquitina (UBL) cuyo objetivo es anclar las proteínas de la familia LC3/GABARAP a la membrana. Esta familia está compuesta por seis proteínas ortólogas a la proteína Atg8 de levaduras. El principal objetivo de esta tesis fue explorar los posibles distintos papeles de sus seis miembros. LC3A y LC3B fueron identificadas como las encargadas del reconocimiento de mitocondrias durante la autofagia mediada por la externalización de la cardiolipina. GABARAP y GABARAPL1 una vez unidas a membrana fueron las proteínas capaces de producir una mayor agregación y fusión de vesículas, presentándose como los principales candidatos para participar en la expansión del autofagosoma. Además, uno de los componentes de los sistemas UBL, el complejo E3, se identificó como inhibidor de la capacidad de fusión de estas proteínas.

Esta tesis pretende explorar la función de los esfingolípidos en el crecimiento celular y en la composición y las propiedades físicas de las membranas. Para ello se han utilizado células que poseen una síntesis limitada de esfingolípidos. Tanto células modificadas genéticamente como tratadas químicamente. A lo largo del estudio se han utilizado diferentes técnicas biofísicas para la caracterización de estas propiedades: sobre todo la espectroscopía y microscopía fluorescente, la microscopia de fuerza atómica y la espectrometría de masas. Esta investigación demuestra que existe una clara correlación entre la disminución del contenido de SL de las membranas y los cambios biofísicos en las propiedades biofisicas de las mismas: Las membranas celulares se vuelven más fluidas al medirlas mediante la polarización general de laurdan y son más penetrables al inducir su ruptura mediante la espectrometría de fuerza (AFM). Cuando las cantidades de SL se reducen en las membranas celulares, las células CHO y HAP1 intentan mantener su orden de membrana nativo mediante una respuesta homeostática en su síntesis lipídico: Sintetizan más glicerofosfolípidos totalmente saturados y menos insaturado. Las LY-B (SPT deficiente) mantienen el orden molecular de sus membranas solo parcialmente, ya que su membrana plasmática es más penetrable en comparación a las de la línea celular CHO (wild type). Por otro lado, la línea celular humana HAP1-SPT (SPT deficiente) mantiene el orden de sus membranas, ya que no existen diferencias en comparación a la penetrabilidad de la membrana plasmática de las células HAP1 (wild type).

Las enfermedades neurodegenerativas (ENs) son un grupo de trastornos neurológicos caracterizados por la degeneración progresiva de la estructura y función del sistema nervioso central y periférico. Las ENs se caracterizan por la deposición de agregados proteicos denominados amiloides. La eliminación de estos agregados la lleva a cabo la red de homeostasis proteica compuesta por la maquinaria de traducción, chaperonas moleculares y cochaperonas, el sistema ubiquitina-proteasoma and las vías de autofagia. En esta tesis doctoral hemos profundizado en el mecanismo utilizado por las chaperonas para desensamblar amiloides de las proteínas ¿-sinucleina y tau, implicadas en las enfermedades de Parkinson y Alzheimer, respectivamente. Hemos visto que la desagregasa humana, compuesta por la chaperona Hsc70 y sus cochaperonas DnaJB1 y Apg2, desensamblan fibras amiloides mediante un proceso de despolimerización desde los extremos que se propaga a través del eje de la fibra. Este mecanismo es crucial para que las chaperonas desagreguen preferentemente los sustratos más pequeño, que son los más tóxicos. Para desagregar fibras grandes, la desagregasa humana parece colaborar con el proteasoma, el cual es capaz de fragmentar amiloides para su posterior procesado por las chaperonas. Por otra parte, demostramos que el truncamiento del dominio C-terminal de ¿-sinucleina bloquea la desagregación de amiloides de esta proteína. Por último, vemos que el polimorfismo de fibras amiloides tiene un impacto en la actividad de las chaperonas, existiendo estructuras más resistentes a la desagregación.

La Dinamina1 es una GTPasa implicada en el proceso de fisión de membrana durante la endocitosis. Para ello, la Dinamina1 adopta una estructura helicoidal alrededor de los cuellos de membrana. Utilizando la energía de la hidrólisis del GTP, esta maquinaria proteica constriñe y fisiona estas estructuras lipídicas. La estequiometría y los mecanismos de autoensamblaje de esta maquinaria helicoidal de fisión son objeto de debate actualmente. Para resolver estas cuestiones, reconstituimos la reacción de fisión de membrana, utilizando un sistema mínimo constituido por tubos lipídicos y la proteína estudiada marcada. Estudiamos, en tiempo real y constante presencia de GTP, la acción de pequeños oligómeros de Dinamina1 sobre los nanotubos lipídicos. A concentraciones bajas de proteína, dichos oligómeros eran menores a un anillo helicoidal de proteína. Aún así, estas estructuras no helicoidales eran capaces de mediar la fisión de las membranas. Además, mediante el uso de la nanotecnología, creamos un modelo de membrana que nos permitió estudiar un mecanismo de autoensamblaje alternativo, por el cual las estructuras no helicoidales de Dinamina1 eran capaces de enrollarse alrededor de la membrana y llevas a cabo su ruptura.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system, that leads to neurological disability. The disease course and clinical phenotype are highly variable and therefore, biomarkers that can aid in the clinical practice are needed. Previous studies have shown a dysregulation in the coding and non-coding RNAs and proposed some as biomarkers. However, still none of them have reached the clinical practice. Recently, circular RNAs (circRNAs) have emerged as new players in the transcriptome that hold a great potential as biomarkers thanks to the features endowed by their circularity. In this thesis, we have performed different approaches to characterise the circRNA expression in leukocytes, peripheral blood mononuclear cells and extracellular vesicles from MS patients. Results have revealed hundreds of circRNAs whose expression is changed in the disease, and we have proposed eleven of them as potential minimally-invasive biomarkers. Finally, our functional experiments indicate that circRNAs may act as regulators of the immune response. This thesis opens a new research line in MS for future investigations to further evaluate the biomarker potential and the function of circRNAs in MS.

Los axones neuronales están recubiertos de una membrana lipídica llamada mielina, que protege a los axones y posibilita una transmisión rápida y eficiente del impulso eléctrico. En ciertas patologías como la lesión cerebral traumática, la isquemia o principalmente, en la esclerosis múltiple, la pérdida de mielina o desmielinización da lugar a la muerte neuronal y por consiguiente a la pérdida de capacidades cognitivas. Este estado puede ser revertido por medio de la remielinización, en la que los oligodendrocitos mielinizantes del sistema nervioso central regeneran la vaina de mielina, evitando la degeneración de las neuronas. En los últimos años se ha realizado un esfuerzo considerable en el desarrollo de terapias remielinizantes. Para ello, es imprescindible el desarrollo de técnicas para la evaluación no-invasiva de estas terapias y una caracterización profunda de los procesos de desmielinización y remielinización. En este contexto, la imagen por resonancia magnética (IRM) juega un papel fundamental por su carácter no-invasivo, alta resolución y versatilidad. Los principales objetivos de esta tesis han sido el desarrollo de protocolos de IRM para la cuantificación de mielina y la caracterización de los procesos de remielinización y desmielinización a través de resonancia magnética funcional en reposo. Para ello se ha utilizado como base el modelo murino cuprizona, en la que la administración del tóxico da lugar a la desmielinización en el cerebro, seguido por la remielinización. Los datos y conclusiones obtenidas se han contrastado en otros modelos de ratón, como en modelos de Alzheimer o en ratones sanos envejecidos. A grandes rasgos, hemos podido concluir que la imagen ponderada en peso T2 es la más específica y sensible para la cuantificación de mielina en el modelo cuprizona. Por ello, en este trabajo se propone la utilización de la imagen ponderada en peso T2 para la evaluación de terapias remielinizantes en el modelo cuprizona. Sin embargo, el interés de realizar imagen multiparamétríca ha quedado al descubierto al realizar imagen de modelos de ratón de Alzheimer, pudiendo detectar patología no relacionada con pérdida de mielina en zonas de materia blanca. Así mismo, hemos podido comprobar como la desmielinización conlleva la pérdida de la conectividad y función cerebral y la remielinización posibilita la recuperación por medio de la resonancia magnética funcional en reposo. Además, el potencial agente remielinizante clemastina, ha demostrado su capacidad de promover la remielinización a nivel anatómico y funcional tras 2 semanas de tratamiento. Finalmente, se ha realizado un estudio para determinar el efecto del envejecimiento en la conectividad del cerebro. Hemos podido observar que en ratones sanos, se ha observado un incremento de la conectividad cerebral hasta el mes 8, seguido de un descenso hasta el mes 13, probablemente debido a la neurodegeneración. En este trabajo hemos contribuido al desarrollo de terapias remielinizantes, por un lado, desarrollando protocolos de imagen para la cuantificación de mielina en modelos animales y por otro lado, caracterizando la desmielinización y remielinización a nivel funcional y anatómico.

La división mitocondrial es un proceso crucial para la viabilidad celular. Fallos en ella originan multitud de patologías. El último paso de la división mitocondrial es la fisión de su doble membrana lipídica. En este Tesis se ha desarrollado un modelo in vitro de nanotubos lipídicos que imita el cuello mitocondrial que se produce antes de su fisión. Sobre él, se ha estudiado cómo las proteínas GTPasas de la familia de las Dinaminas, Drp1 y Dyn2, implicadas en el momento de la fisión mitocondrial, llevan a cabo el proceso de fisión. Drp1 no fue capaz de producir la fisión de los nanotubos de manera autónoma, viéndose influida esta acción por su etiquetado. Por el contrario, Dyn 2 sí llevó a cabo la fisión de los nanotubos, lo que indica que tiene un rol en llevar a cabo la división mitocondrial. Además, puede producir la fisión de la membrana interna independientemente del GTP, lo que se ha comprobado por Cryo-EM. Por primera vez, hemos visto la interacción de ambas proteínas in vitro. Estas actuarían sinérgicamente para producir la división mitocondrial.

Los virus filamentosos flexibles de plantas representan un grupo de patógenos de plantas que causan un gran impacto económico en cultivos dedicados a la agricultura. El géneropotyvirus es el más numeroso y abarca hasta un tercio de las especies de virus conocidas. El principal objetivo de este trabajo es la obtención de más información estructural sobre los virus filamentosos flexibles de plantas, usando las metodologías de crio-microscopía electrónica (crio-ME) y crio-tomografía electrónica (crio-TE). En éste trabajo, la estructura del virus del mosaico del nabo (Turnip mosaic virus, TuMV) ha sido resuelta a 5 Å mediante crio-ME, así como la estructura de sus partículas como virus (Viral like particles, VLPs) a resoluciones entre 7 y 8 Å. Mediante crio-TE se ha explorado la estructura de los extremos de los filamentos, encontrando dos estructuras diferenciadas, una con forma de hélice y otra con un final plano con una densidad alargada adicional que podría pertenecer a otra proteína potyviral, la VPg. Finalmente, se ha realizado la búsqueda de compuestos químicos que interaccionan al bolsillo de unión de la proteína de la cápside con el ssRNA mediante técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) y se estudió la naturaleza de la interacción mediante crio-ME.

Tesi honetan, aurretiaz Drosophila melanogaster eulian eta saguetan identifikatutako UBE3Aren balizko substratuak balioztatu ditugu, horretarako moldatutako purifikazio estrategia bat erabiliz ¿GFP pull-down estrategia¿. Halaber, estrategia hori masa espektrometriarekin konbinatuz UBE3Ak edozein substratutan sortutako ubikitina kate-motak eta substratu horien ubikitinazio-guneak identifikatzeko baliogarria dela egiaztatu dugu. Horrez gain, giza deubikitinasa (DUB) ezberdinak testatu ditugu, eta USP9X identifikatu dugu UBE3Aren aurkako funtzioa burutzen duen DUB gisa. USP9Xren inhibizioak UBE3Aren substratu den DDI1 proteinaren ubikitinazioa emendatzen du. Era berean, Angelman sindromearen modelo diren eulien fenotipoa ere hobetzen du, eta horrek, etorkizunean ASrentzako tratamenduak garatzen lagundu dezake. Inhibitzaile horren ondorioz, ubikitinazio-maila aldatzen duten, eta beraz, eulien fenotipoa hobetzearen eragile izan daitezkeen proteinak identifikatu ditugu masa espektrometrian oinarritutako esperimentu baten bidez. UBE3Arekin elkarrekin eta ligasaren funtzioa erregulatu dezaketen hainbat proteina ere identifikatu ditugu, baita proteina horiek UBE3Aren amino muturrarekin, karboxilo muturrarekin edo proteina osoarekin elkarrekiten duten zehaztu ere. Azkenik, UBE3Aren egitura osoa definitzeko helburuarekin, ligasa modu eraginkorrean purifikatzeko protokoloa ezarri dugu, eta UBE3A gainadierazten duten saguen portaera ikertu dugu.

GIBaren gainazalean kokatzen den Env proteina da birusaren infekzioa hasteko gertatu behar den birusaren eta itu zelularen mintzen arteko fusioa eragiten duena eta immunitate sistemarentzako eskuragarri dagoen proteina bakarra. Beraz, GIBaren aurkako txerto profilaktiko bat garatzeko itu ezin hobea da. Halaber, GIBaren infekzioa blokeatzeko gaitasuna duten espektro zabaleko antigorputz neutralizatzaileak isolatu dira kutsatutako zenbait indibiduoen serumetik, birus honen aurkako erantzun immune babeslea sor daitekeela frogatuz. Antigorputz hauen artean, birusaren mintzean txertatuta dagoen MPER sekuentzia ezagutzen dutenak, espektro zabalena erakusten dute. Horrez gain, oso kontserbatua dagoen eskualdea da. Anti-MPER antigorputzek mintzarekin kontaktuan dagoen sekuentzia bat ezagutzen dutenez, MPER domeinuan oinarritutako antigenoa sortzeko mintz ingurune hori mantentzea garrantzitsua dela argudiatu da. Beraz, lan honetan 10E8 moduko antigorputz neutralizatzaileak sortzeko gai diren lipido-peptido formulazioen (LPF) diseinu arrazionalerako lagundu dezaketen zenbait baldintza definitu dira. Lehenbizi, N-MPER sekuentzia ezabatu beharko litzateke antigorputzen erantzuna 10E8aren epitopora bideratzeko. Gainera, transmintz domeinua gehitzean immunogeno egonkorragoak sor daitezkeela ikusi da eta domeinu honen sekuentziaren luzerak, epitopoaren irisgarritasuna eta ondorioz, antigorputzen afinitatea modula dezake. Azkenik, epitopoak mintzen gainazalean duen aurkezpena hobetzeko, LPFak kolesterolik gabe diseinatzea gomendagarriagoa dela ikusi da.

GIBak Env fusio glukoproteina erabiltzen du CD4 hartzailea adierazten duten zelulak infektatzeko. Immunitate sistemari eskuragarri dagoen antigeno bakarra izan arren, Env-ek honi ihes egiteko dituen mekanismoek erantzun egoki baten garapena izugarri zailtzen dute. Hala ere, azken urteetan GIBaren infekzioa blokeatzeko gaitasuna erakusten duten espektro zabaleko antigorputz neutralizatzaileak isolatu dira paziente batzuetatik, eta gaur egun erabiltzen den terapia antierretrobiralean oinarritzen den tratamenduaren osagarri edota ordezko aukera bezala proposatuak izan dira. Antigorputz neutralizatzaile hauen artean, mintz biralean txertatuta aurkitzen den MPER (ingelesetik, ¿membrane proximal external region¿) sekuentzia itu dutenak erakutsi dute espektro zabalena eta tesi lan honetan, hauen potentzia emendatzeko birusaren mintzarekin egiten dituzten elkarrekintzak bultzatu nahi izan dira. Anti-MPER antigorputzak mutagenesi konbentzionala erabiliz, zuzendutako konposatu aromatikoen konjugazioaren bidez eta espezifitate desberdineko bigarren batuketa-bloke bat erantsiz eraldatuak izan ondoren, antigorputz basatiak baino 10-100 aldiz potentzia altuagoa duten aldaerak eskuratu dira, antigorputzen eta mintzen interfasearen arteko elkarrekintzen sustapena potentzia emendatzeko estrategia egokia dela frogatuz.

El diseño de proteínas permite construir herramientas nanotecnológicas adaptadas para su uso en campos como la biomedicina o la industria. Las proteínas de repetición CTPR son una buena opción para desarrollar nano-herramientas dada su estructura modular y tolerancia a mutaciones, lo que permite combinar módulos funcionalizados sin comprometer la estabilidad de la proteína. Además, las proteínas CTPR pueden modificarse para desarrollar módulos que coordinan metales, lo que permite la unión de nanomateriales metálicos con propiedades interesantes como las nanopartículas de oro, o la síntesis de nanocristales metálicos in situ. En la presente tesis doctoral se propone un sistema modular de proteínas CTPR funcionalizadas con nanomateriales metálicos para su aplicación como herramientas nanotecnológicas en sensórica, imagen y bioelectrónica. Para ello, primero se establece un diseño de CTPR con residuos de coordinación de metales y se estudia en profundidad las propiedades fotoluminiscentes que emergen de nanocristales de oro coordinados a dichas CTPR. A continuación, se elaboran diseños de CTPR coordinando nanomateriales metálicos y se aplican como sensores de parámetros ambientales, como la temperatura o la presencia de iones metálicos; como sondas fluorescentes para detección correlativa de orgánulos celulares usando microscopía de fluorescencia y fluorescencia de rayos-X; y como bloques de construcción para elaborar biomateriales conductores.

En un primer momento, los procesos de envejecimiento y cáncer podrían parecer opuestos. Sin embargo, el hecho de que compartan tanto la acumulación del daño celular como origen común, como un sello molecular similar, hace que se conviertan en dos manifestaciones distintas de los mismos procesos subyacentes. Entre estas alteraciones moleculares se encuentra la desregulación del conjunto de células madre. En esta tesis doctoral, demostramos que la autofagia mediada por chaperonas promueve la capacidad tumorigénica de las células madre del glioma, regulando vías proteómicas y transcriptómicas asociadas a la proliferación, auto-renovación, metabolismo, respuesta inmune e interacciones con la matriz extracelular. Por otro lado, revelamos el enriquecimiento de la expresión de HDAC6 en la subpoblación de células madre del glioma, e identificamos un nuevo inhibidor de HDAC6 con gran selectividad de diana y efecto citotóxico en células madre de glioma, incluso más potente que la de otros inhibidores de deacetilasas de histonas actualmente disponibles. Además, ampliamos el estudio de las deacetilasas de histonas al contexto del envejecimiento cerebral, mostrando evidencias preliminares que indican el aumento en la expresión de las deacetilasas de histonas en varias regiones del cerebro, como es el caso del hipocampo, con el envejecimiento, correlacionando a su vez con el envejecimiento microglial.

The transcriptional co-regulator peroxisome proliferator-activated receptor gamma co- activator 1 alpha (PGC1¿) was shown to exert a tumor suppressive role in prostate cancer (PCa) by means of regulating the balance between anabolism and catabolism. This anti-tumoral activity happened to be dependent on its partner oestrogen-related receptor alpha (ERR¿). Classically, the roles attributed to PGC1¿ under physiological and pathological conditions were linked to the regulation of metabolic processes. Yet, in the present work we have deciphered that the transcriptional reprogramming induced by PGC1¿ in PCa epithelial cells extends to novel functions. We show that the anti-tumoral effects of PGC1¿ seem to be driven by cell-intrinsic and cell-extrinsic phenomena that include the regulation of cell cycle, interferon response and the secretome composition. Indeed, secretome fractionation into extracellular vesicles (EVs) and soluble factors (SFs) revealed a differential protein composition upon expression of PGC1¿. This secretome fractionation also drove us to conclude that despite EVs produced by PGC1¿- expressing and non-expressing cells showed no distinct biological roles, they could be used as non-invasive bystanders of PCa progression. We also show that PGC1¿-driven SFs seem to promote metastasis formation in vivo. On the other hand, PGC1¿- ERR¿-regulated SFs were shown to suppress proliferation capacity of PCa cells in vitro. Overall, data further suggests that PGC1¿-regulated SFs (probably involving IFN-ß secretion) activate autocrine and paracrine tumor-suppressive mechanisms in PCa cells. Hence, due to the tumor suppressive role and stratification potential of PGC1¿, we believe that understanding its contribution on the regulation of the cell secretome could allow us to decipher the cell communication networks established between PCa epithelial cells and the stromal compartment. This could open new avenues for the identification of non-invasive biomarkers of PCa progression as well as the development of novel therapeutic strategies to treat aggressive PCa.

El término proteostasis se refiere a todos aquellos procesos biológicos críticos para el buen funcionamiento de la célula. La alteración de las vías reguladoras de la proteostasis puede afectar seriamente la función celular y causar la aparición de enfermedades, incluidas enfermedades raras como el Síndrome de Townes-Brocks (TBS) y la Porfiria Eritropoyética Congénita (CEP). La CEP es causada por una deficiencia en la cuarta enzima de la vía de producción del grupo hemo, UROS. El alelo patógeno más común, C73R, genera una proteína inestable con menos del 1% de la actividad normal, lo que conduce a la acumulación de porfirinas y a fenotipos graves. El modelo clásico de ratón C73R tiene poca viabilidad y presenta problemas de salud crónicos, lo que plantea desafíos para su uso experimental. Para generar un modelo de ratón humanizado, inducible, mutante para CEP, diseñamos un nuevo interruptor genético de inserción única para reemplazar el alelo Uros del ratón con una versión controlada condicionalmente. El UROS humano reemplaza y rescata la función UROS del ratón y, tras la inducción con tamoxifeno de la recombinasa Cre, el alelo expresa la versión mutante C73R. Para verificar su funcionalidad, se testó el sistema en fibroblastos murinos. Se usó CRISPR/Cas9 para introducir la construcción en las células. El correcto funcionamiento del sistema fue validado tanto a nivel de ADN como de proteína. Se realizaron análisis FACS y HPLC para medir los niveles de porfirinas e investigar la actividad de UROS. Este modelo celular, así como el modelo de ratón knock-in planificado, serán herramientas novedosas para permitir estudios más profundos en CEP y probar posibles terapias. El TBS está causado por mutaciones en el represor transcripcional de dedos de zinc SALL1 y se caracteriza por un espectro de malformaciones en dígitos, oídos y riñones. Para dilucidar las funciones y la regulación de SALL1 en el contexto de las modificaciones postraduccionales, se utilizó un ensayo de proteómica de proximidad BioID en combinación con espectrometría de masas para identificar posibles interactores de SALL1 humano. Entre éstos, encontramos CBX4, una E3 SUMO ligasa y un miembro clave del Complejo Polycomb 1 de Represión involucrado en la remodelación de la cromatina y el silenciamiento génico. Confirmamos que SALL1 y CBX4 interactúan entre sí a nivel de proteína y que colocalizan en el nucleoplasma. Al modificar su ubiquitinación y su posterior degradación a través del proteasoma, SALL1 estabiliza y aumenta los niveles de proteína de CBX4, afectando así la formación de cuerpos nucleares Pc que parecen más abundantes y más grandes. Además, altos niveles de SALL1 aumentan la capacidad de represión transcripcional de CBX4 en algunos de sus genes diana. Curiosamente, la SUMOilación de SALL1 parece ser necesaria para mejorar el efecto de represión transcripcional de CBX4. Elucidar la relación subyacente a la interacción entre SALL1 y CBX4, podría ayudar a comprender mejor el papel de SALL1 durante el desarrollo normal y en la patogénesis de TBS. En conjunto, los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo podrían ayudar a comprender mejor la patogénesis de estas dos enfermedades raras y podrían ayudar en el avance del desarrollo de potenciales

Wnt-11 es un miembro no canónico de la familia de Wnt que se observa altamente expresado en líneas celulares de cáncer de próstata, así como en tumores de próstata. Wnt-11 promueve la migración y la invasión celular lo que sugiere que tiene un papel en la progresión y la metástasis del cáncer de próstata. Las proteínas Wnt necesitan unirse a la familia de receptores Frizzled (FZD) para activar la señalización de forma que esta interacción representa una oportunidad para inhibir la señalización de Wnt. Sin embargo, se desconocen los receptores que median la señalización de Wnt-11 en cáncer de próstata. En esta tesis, proporciono evidencia de que FZD8 es el principal receptor de Wnt-11 en cáncer de próstata y de que éste integra las señales de Wnt-11 y TGF-¿ con el fin de promover la invasión celular y la transición epitelio-mesénquima (EMT) y así mediar la progresión del cáncer de próstata. La expresión de FZD8 a nivel de RNA mensajero se vio incrementada en múltiples bases de datos de cáncer de próstata, así como en líneas celulares de cáncer de próstata metastático. Asimismo, el análisis de muestras de pacientes mostró niveles aumentados de FZD8 en tejidos de próstata cancerosos comparados con tejido sanos de próstata, que también se relacionaron con niveles elevados de Wnt-11. En líneas celulares de cáncer de próstata metastático, FZD8 co-localizó y co-inmunoprecipitó con Wnt-11 además de mediar la activación que Wnt-11 produce en la señalización no-canónica de ATF2 y AP-1. Funcionalmente, el silenciamiento de FZD8 redujo la migración y la invasión de las células cancerosas, así como la invasión en cultivo organotípico tridimensional (3D) y la expresión de genes implicados en EMT. Además, FZD8 resultó necesario para el crecimiento tumoral en el modelo in vivo de la membrana corioalantoidea (CAM). Finalmente, se observó una inhibición de la ruta de TGF-¿/Smad cuando FZD8 se silenciaba en células de cáncer de próstata y FZD8 resultó ser necesario para la invasión celular dependiente de TGF-¿¿así como para la expresión de genes de EMT. Inesperadamente, FZD8 resultó formar un complejo regulado por TGF-¿ con los receptores de TGF-ß, el cual está mediado por los dominios extracelulares de FZD8 y TGFßRI. Todos estos resultados son consistentes con un modelo en el que FZD8 integra las rutas de señalización de Wnt y TGF-ß para promover la migración, invasión celular y el proceso de EMT, dando lugar a la metástasis del cáncer de próstata. Consecuentemente, FZD8 puede representar una óptima diana terapéutica en el cáncer de próstata metastático ya que su inhibición puede bloquear la activación aberrante de ambas rutas, Wnt y TGF-¿.

Los estudios de identificación de nuevos biomarcadores reciben una cantidad notable de financiación, pero su éxito es reducido, con solo un 0.1% de los nuevos biomarcadores identificados llegando a implantarse en la práctica clínica rutinaria. Las tecnologías de alto rendimiento (ómicas) permiten la medición de una cantidad muy elevada de variables, facilitando así la posible identificación de nuevos biomarcadores. Los desarrollos tecnológicos más recientes han permitido abaratar sus costes, facilitando así la implantación y globalización de este tipo de estudios. A su vez, esto ha supuesto un incremento en el número de candidatos a biomarcador que no superan las fases de validación, en parte por la falta de protocolos y métodos de análisis estandarizados y robustos para este tipo de datos. En esta tesis, hemos estudiado qué métodos son más eficientes en la identificación de biomarcadores derivados de la combinación de distintas ómicas, principalmente microbioma y metabolómica. Nos hemos centrado en la identificación de nuevos biomarcadores diagnósticos para tres enfermedades con un elevado impacto socioeconómico: el cáncer de próstata, el cáncer colorectal y la fibromialgia. Para todos los potenciales biomarcadores identificados hemos estudiado su robustez y capacidad predictiva mediante una combinación de métodos bioinformáticos y experimentales, para tratar de aportar biomarcadores capaces de superar la fase de validación correspondiente con éxito.

En esta tesis doctoral se ha estudiado el papel de los lípidos en distintos pasos del ciclo infectivo del VIH-1, y su potencial uso para el desarrollo de agentes antiretrovirales. Los resultados de este trabajo demuestran que la proteína gp41 del VIH-1 interacciona con colesterol tanto en la membrana plasmática como en la membrana viral, y que las secuencias LLP de la cola citoplásmatica de la proteína están involucradas en esta interacción. También se ha estudiado el mecanismo de acción de compuestos antirretrovirales sintéticos similares a lípidos naturales, conocidos como lipidomiméticos. Se ha descubierto que éstos llevan a cabo su acción antirretroviral inhibiendo el paso de entrada al alterar la estructura de la membrana viral y el estado de empaquetamiento de los lípidos. En esta tesis se desarrolló también un sistema de nanopartículas con gangliósidos que pueden ser específicamente focalizadas a células dendríticas maduras y transferidas a células latentemente infectadas mediante la ruta gangliósido/Siglec-1 para el transporte de agentes reactivadores de latencia, con el fin de purgar los reservorios virales que establecen una infección latente.

El tamoxifen, un antagonista de ER, es el tratamiento más común empleado para tratar a pacientes que expresan ER. Las células resistentes a tamoxifen están enriquecidas en células madre/progenitoras. La expresión de WNT1 es heterogénea entre los distintos subtipos de cáncer de mama. Además, Wnt-1 activa una señalización independiente de la ¿-catenina y mediada por ATF2 y TCF1 y es, además, potenciada por la expresión de USP6, que regula la degradación y el reciclaje de los receptores FZD. Se ha observado que Wnt-1 incrementa la población de células CD44+CD24-/low y la habilidad de formar esferas en células resistentes a tamoxifen., consistente con el peor pronóstico que presentan los pacientes de cáncer de mama con tumores que expresan ER y han recibido tratamiento con tamoxifen. Se identificó FZD5 como un receptor de Wnt que se correlaciona con un peor pronóstico de pacientes de cáncer de mama tratados con tamoxifen y que capaz de interaccionar con Wnt-1. El bloqueo de la señalización de Wnt-1 evitando su unión a FZD5 podría ser una buena estrategia para prevenir la recurrencia en un grupo determinado de pacientes de cáncer de mama.

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus perteneciente al género Lentivirus que infecta principalmente linfocitos T CD4+. El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un espectro de enfermedades causado por la infección por VIH, que interfiere con el correcto funcionamiento del sistema inmune y aumenta el riesgo de infecciones oportunistas que acaban causando la muerte del paciente. En 2016, alrededor de 36.7 millones de personas vivían infectadas por el VIH tipo 1 (VIH-1) y se produjeron cerca de 1 millón de muertes relacionadas con el SIDA. El VIH está recubierto de una bicapa lipídica adquirida de las células huésped durante la gemación. La proteína de envuelta (Env) es la única de origen viral que se expone en esta membrana. Env es responsable del reconocimiento del receptor CD4 y los correceptores CCR5 o CXCR4 en la membrana plasmática de la célula objetivo mediante la subunidad gp120 y la subsecuente fusión de las membranas celular y viral, mediada por la subunidad transmembrana gp41. Este proceso da lugar al poro de fusión por el que la cápside del virus se libera al citosol de la célula huésped. A pesar de que la envuelta lipídica es adquirida de la membrana plasmática de la célula infectada, la composición química de ambas es muy diferente, la membrana del virus se encuentra enriquecida en lípidos como el colesterol (hasta un 50% del contenido lipídico total). Por ello se ha propuesto que el virus adquiera su membrana de balsas lipídicas o lipid rafts en la membrana celular. Los rafts son nanodominios temporales enriquecidos en colesterol, esfingolípidos y ciertas proteínas a los que se les adjudica diferentes funciones gracias a la compartimentalización de elementos de la membrana plasmática. Se desconoce la razón por la que la gemación del VIH ocurre a través de estos dominios, sin embargo diferentes estudios han demostrado que la composición de la membrana viral es crítica para la infección, es decir, que la membrana juega un papel activo durante la fusión. En esta tesis se han estudiado diferentes características y procesos que ocurren a nivel de la envuelta del VIH-1 mediante técnicas de microscopía avanzada, que han permitido la cuantificación de diferentes parametros biofísicos. En primer lugar se ha analizado el grado de empaquetamiento de bicapas lipídicas en vesículas unilamelares gigantes utilizando microscopía de dos fotones de la sonda fluorescente Laurdan, que permite, mediante la función GP, cuantificar el orden molecular de una membrana. Durante la implementación de esta técnica e inicialmente como método de validación de la misma, se ha construido un diagrama de fases de GP de la mezcla lipídica DOPC:colesterol:esfingomielina. Además se han identificado ciertas fuentes de segregación lateral artefactual, que se pueden evitar mediante la excitación por dos fotones, por ejemplo, la fotooxidación. El diagrama de fases puede ser utilizado como herramienta para definir mezclas lipídicas que emulen una membrana biológica deseada. Para definir la organización y función de la membrana viral, se ha extraído el contenido lipídico de virus infectivos. Estas mezclas lipídicas han sido reconstituidas en vesículas unilamelares gigantes y monocapas Langmuir-Blodgett para analizar su grado de orden molecular y comportamiento de fases. La determinación del nivel de empaquetamiento ha permitido el desarrollo de mezclas lipídicas que emulan la membrana viral y han sido utilizadas en los capítulos posteriores como modelo de la envuelta lipídica. Mediante microscopía de fuerza atómica se ha demostrado que la membrana viral puede organizarse en nanodominios. También se ha analizado el efecto de compuestos virucidas que actúan a nivel de membrana en los citados parametros biofísicos. Los resultados obtenidos sugieren que un agente capaz de interferir con la nanoorganización de la membrana viral podría inhibir la infección. Basado en estas evidencias se ha procedido al estudio del mecanismo de inhibición mediada por péptidos derivados del dominio MPER de la proteína gp41 del VIH-1. Únicamente un péptido cuya secuencia comprende el dominio MPER y parte del dominio TMD ha presentado actividad virucida (MPER671¿693). A pesar de que otros péptidos son también capaces de alterar la nanoorganización de membranas modelo, sólo MPER671¿693 parece estructurarse en los límites de dominios lipídicos y presentar la capacidad de inducir permeabilización de membranas modelo, dos procesos que parecen estar relacionados con su actividad virucida. Por último, se ha estudiado el mecanismo de unión de anticuerpos de amplio espectro anti-MPER directamente a viriones utilizando microscopía de fluorescencia de superresolución. De este modo, se ha determinado que los anticuerpos anti-MPER y anti-gp120 reconocen el mismo tipo de agrupaciones de Env en la membrana viral. Además se ha establecido una correlación entre la unión y la neutralización en el caso de los anticuerpos anti-MPER 4E10 y 10E8, que parece depender de la capacidad de establecer interacciones con lípidos, aunque en ningún caso se ha observado una interacción directa entre 4E10 o 10E8 y la membrana viral. Experimentos de espectroscopía de correlación de fluorescencia realizados utilizando membranas modelo sugieren que la interacción entre 4E10 y la membrana es superficial e inespecífica, además de estar impedida debido al alto empaquetamiento de la envuelta lipídica. En conclusión, los estudios de microscopía avanzada realizados durante esta tesis han permitido la caracterización y mayor comprensión de la membrana del VIH-1 y del mecanismo de inhibición y neutralización de compuestos y anticuerpos anti-VIH en el contexto de la membrana viral.

La transformación y la progresión tumoral van acompañados de cambios metabólicos. Los principales co-reguladores metabólicos son capaces de orquestar la modulación de múltiples rutas metabólicas a través de la regulación de programas transcripcionales. En esta tesis hemos mostrado que el co-regulador transcripcional y metabólico PGC1¿ suprime la progresión tumoral y metastática en el cáncer de próstata. El análisis bioinformatico de los principales co-reguladores metabólicos reveló a PGC1¿ como factor principalmente alterado en cáncer de próstata, cuya expresión disminuía y estaba asociada a la progresión tumoral. Usando modelos de ratón y xenotransplantes, demostramos la inhibición de la progresión tumoral y metástasis por parte de PGC1¿. La integración de análisis metabólicos y transcriptómicos reveló que PGC1¿ activa un programa transcripcional dependiente del factor de transcripción ERR¿, el cual inducía un estado catabólico responsable de la supresión metastática. Además, hemos observado que la expresión de este co-regulador altera la remodelación del citoesqueleto, induciendo cambios en la morfología celular. Finalmente, una marca genética basada en la activación del programa transcripcional (PGC1¿-ERR¿) exhibe potencial pronóstico en cáncer de próstata. El uso tanto de la marca genética como del estudio metabólico realizado podría permitir la estratificación de pacientes y el desarrollo de nuevas terapias en el cáncer de próstata.

La homeostasis de tejidos es considerado como el equilibrio entre la muerte y proliferación celular, y es por ello que su desregulación a menudo está asociada a diversas situaciones patológicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o el cáncer. Este equilibrio, se encuentra regulado principalmente por un mecanismo denominado apoptosis o suicidio celular. La familia de proteínas BCL2 se erige como pieza clave en la regulación de este mecanismo, principalmente, a nivel de la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MEM). En las últimas décadas, se han realizado avances de notoria importancia en el conocimiento sobre los mecanismos de acción e interacción de esta familia de proteínas, Sin embargo, importantes aspectos del proceso de activación de las proteinas proapoptóticas tipo BAX (BAX, BAK y quizás BOK) se encuentran vagamente descritos, desconociendo entre otros aspectos la disposición estructural exacta que la proteína BAX adopta en membrana o la cantidad mínima de subunidades de BAX necesarias para la formación del poro. Por otra parte, puesto que la membrana conforma el locus biológico de estas proteinas, el estudio del componente lipídico y de la propia membrana se encuentra actualmente en boga. Concretamente, el lípido especifico de la mitocondria, cardiolipina (CL), se ha erigido como uno de los moduladores claves de la apoptosis. Sin embargo, a pesar de su importancia, la función exacta de la CL en particular y de los lípidos en general, en las actividades de membrana de las BCL2, se encuentra vagamente descrita. Además, dilucidar el modo de acción de las proteinas antiapoptóticas o tipo BCL2, mediadoras del bloqueo de la actividad de las proapoptóticas, es considerado uno de los pilares fundamentales en el desarrollo de posibles dianas terapéuticas. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido avanzar en la comprensión de los mecanismos de acción de la familia de proteínas BCL2, así como de los factores reguladores que modulan su actividad durante la apoptosis. Concretamente, nos centramos en dos miembros de la familia: la proapoptótica multidominio prototípica BAX, y la poco estudiada proteína antiapoptótica BFL1. Para la consecución de estos objetivos, se han realizado estudios a nivel de membrana tanto en sistemas modelo como en células, mediante diversas técnicas biofísicas cuantitativas. Considerando todo referente a la topología de BAX en membrana, concluimos que en ausencia de estímulo apoptótico BAX adopta una estructura globular apoyando su C-terminal en la membrana, conformación a la cual hemos denominado ¿lipid primed¿, ya que el lípido parece favorecer la exposición del bolsillo hidrofóbico que actuará como receptor en el proceso apoptótico. Sin embargo, una vez activada, BAX adopta una configuración BH3 into groove donde la inserción del dominio core, pero no del dominio latch, se antoja indispensable para la formación del poro apoptótico. Referente a BFL1 y sus actividades de membrana, concluimos que BFL1 posee un mecanismo de acción multimodal (MODO-0 o retrotranslocación de BAX, MODO-1 o formación de un hetero-complejo con la proteína proapoptótica cBID y MODO-2 interacción con la proteína BAX activa) y bifuncional (fenotipo antiapoptótico y proapoptótico) regulado por la cantidad de CL en la membrana. BFL1 ejerce su actividad antiapoptótica mediada por interacciones canónicas BH3-into-groove mientras que en membranas con alto contenido en cardiolipina, las cuales imitan los microdominios de este lípido descritos en condiciones apoptóticas, BFL1 no solo pierde la capacidad de formar heterodímeros con los miembros proapoptóticos, sino que también es capaz de homodimerizar vía una superficie no descrita previamente situada en el dominio BH4 de la proteína.

La conjugación bacteriana es el mecanismo más importante en la diseminación de genes de resistencia a antibióticos entre bacterias. Este proceso se realiza mediante unos complejos macromoleculares denominados Sistemas de Secreción de Tipo IV. Las proteínas acopladoras forman parte de estos sistemas, siendo una pieza clave en el proceso conjugativo. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido caracterizar el funcionamiento de diferentes proteínas acopladoras, centrándose en el papel de su dominio transmembrana. Para ello se han seleccionado proteínas acopladoras de diferentes sistemas y características. Además se han creado proteínas mutantes (tanto quimeras como de delección) con las que estudiar la función del dominio transmembrana. En concreto se ha estudiado la actividad y la localización subcelular de las diferentes proteínas in vivo. Además se han desarrollado protocolos de purificación obteniendo muestras con las que realizar ensayos in vitro. De esta manera se ha caracterizado la estabilidad de las proteínas, su unión a moléculas de ADN, sus patrones de oligomerización, su estructura secundaria y su actividad ATP hidrolasa. Finalmente, se ha realizado la puesta a punto de técnicas de reconstitución en membranas modelo de las proteínas acopladoras, con el fin de realizar ensayos single-molecule en el futuro. En esta tesis se ha demostrado que las características descritas para la proteína acopladora TrwBR388, el paradigma de esta familia, no son extrapolables a todas las proteínas de la familia, remarcando así la necesidad de más estudios en este campo.

Las vesículas extracelulares (EVs) han surgido como potentes conductores de la comunicación intercelular. Estas nanovesículas lipídicas son secretadas por las células y transportan cargas biomoleculares funcionales de proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y metabolitos a las células receptoras. Hay enormes esfuerzos para reutilizar los EVs con fines terapéuticos. Los EVs pueden cargarse con una carga exógena para la administración selectiva de medicamentos y, en el caso de los EV derivados de células madre mesenquimales, tienen suficientes propiedades regenerativas para ser utilizados directamente sin ingeniería adicional. Recientemente ha habido un aumento de la apreciación del papel de los glicanos EV en los procesos de captación y tráfico dentro del cuerpo. En esta tesis nos proponemos explorar más a fondo cómo la cambiante glicosilación EV altera su captación por las células receptoras, con el objetivo final de tomar nuestros modelos EV de glicoingeniería in vivo para demostrar que la glicoingeniería podría utilizarse para mejorar los productos EV terapéuticos. La clave de nuestro enfoque ha sido el uso de microarreglos de lectinas para ensayar la glicosilación EV y verificar el éxito de nuestros enfoques de ingeniería. Para ello, empleamos tres métodos principales de glicotécnica: enzimas de glicosidasa para alterar los glicanos de superficie de los EVs; pequeños inhibidores moleculares de las enzimas de la vía de glicosilación para tratar las células durante el cultivo; la funcionalización de EVs con estructuras de glicodendro con la química del clic.

En este trabajo hemos puesto de manifiesto que los E2F activadores (E2F1/E2F2) juegan un papel relevante en la regulación del proceso de transición epitelio-mesénquima (EMT) en células de cáncer colorrectal, una función no descrita hasta la fecha para estos factores de transcripción. Hemos demostrado que E2F1/E2F2 actúan como inhibidores del proceso de EMT en líneas celulares de cáncer de colon. La depleción de estos factores conduce a la desestructuración de la monocapa epitelial dando lugar a células con morfología mesenquimal. La adquisición de esta morfología viene acompañada de la deslocalización de la proteína E-cadherina de la membrana plasmática y una pérdida en la capacidad de adhesión intercelular. Además, mostramos que las células de cáncer de colon knockdown para E2F1/2 adquieren capacidad migratoria e invasiva. Mediante un análisis transcriptómico hemos puesto de manifiesto la implicación de E2F1/E2F2 en la regulación de genes relacionados con la motilidad y la adhesión celular en las células HCT116. El enriquecimiento en motivos de unión E2F en el promotor de estos genes sugiere que podrían estar directamente regulados por E2F1/2. Notablemente, hemos demostrado que E2F1/2 regulan de manera negativa la expresión de SLUG, factor de transcripción promotor de EMT, en células de cáncer de colon, y que SLUG actúa como mediador del fenotipo EMT ocasionado por la ausencia de E2F1/2.

E2F transcription factors control diverse biological processes through regulation of target gene expression. The identification of a large set of genes regulated by each individual E2F, including those coding for microRNAs, has led to a better understanding of the functions performed by the different members of the family. Many studies have detailed the role of classical E2Fs in cell cycle control and DNA damage response. By contrast, the contribution of the atypical members of the family, E2F7 and E2F8, to these processes has not been clearly defined. A recent study from our group identified a set of novel microRNAs and protein-coding genes regulated by E2F7. These genes are involved in processes such as cell cycle regulation or DNA damage response. In this work, we have examined the role that E2F7 plays in the regulation of these processes through the transcriptional regulation of its target genes. We have identified E2F7 as a transcription factor required for the repression of a set of microRNAs that promote cellular proliferation. We show that miR-25, miR-92 and miR-7 expression is controlled at the transcriptional level by the antagonistic activity of E2F7 and E2F1-3. Interestingly, we find that several E2F7-repressed microRNAs downregulate the expression of cell cycle progression inhibitors and promote cellular proliferation, suggesting that E2F7 restrains cell cycle progression through repression of proliferation-promoting microRNAs. Importantly, we show that E2F7 plays a key role in the maintenance of genomic stability. We present evidence of E2F7-dependent transcriptional and non-transcriptional mechanisms for modulating cellular responses to genotoxic exposure. We identify an E2F7-dependent transcriptional regulation program that restricts homologous recombination-mediated DNA repair and cellular recovery upon induction of DNA lesions that interfere with replication fork progression (DNA interstrand cross-links and PARP1 inhibition).Additionally, we present evidence of a non-transcriptional mechanism by which E2F7 modulates cellular responses to alkylating DNA damage, possibly involving interaction with the repair protein XRRC1. Loss of E2F7 confers an increased resistance to chemotherapy in homologous recombination-deficient cells, a potentially harmful outcome for cancer treatment. Altogether, results in this work reveal a key role for E2F7 in limiting cellular proliferation and promoting genomic stability by ensuring the timely expression of protein-coding and microRNA genes that are required for cell cycle progression and DNA damage repair.

El colesterol (Col) juega un papel determinante en varios procesos biológicos tales como el tráfico y la señalización intracelular. Estos procesos parecen estar orquestados por nanodominios lipídicos dependientes de Col. Además, cambios en los niveles de Col en el cerebro están directamente asociados con la iniciación y progresión de varias enfermedades neurodegenerativas tales como el Parkinson o el Alzheimer. Sin embargo, el impacto directo del col en la actividad de los receptores de membrana así como su visualización y distribución in situ en células y tejidos mediante microscopia de alta resolución sigue siendo un desafío para la comunidad científica. Con este fin se ha desarrollado un nuevo análogo del Col que permite visualizar los nanodominos ricos en Col en neuronas y la distribución del col en tejidos del cerebro mediante microscopia de fluorescencia. Finalmente, se ha estudiado el impacto del Col y de los dominios lipídicos en la actividad al receptor del interferón-gamma. Hemos descubierto que el Col interacciona de manera específica con el dominio transmembrana de la subunidad 2 del receptor in vivo mediante un domino de unión al Col. Demostramos que el Col desempeña un papel fundamental como regulador específico de la actividad intracelular del receptor de IFN-¿, modulando los procesos de dinámica, oligomerización y señalización celular.

SND1 is an evolutionarily conserved multifunctional protein. Although its function has not been fully elucidated yet, is considered a multifunctional protein participating, among others, in mRNA metabolism, gene transcription and lipid metabolism. There is growing evidence of its physiopathological relevance as SND1 expression level has been described to be upregulated in most of the cancer types studied. The objective of this work was to find out whether the alterations in lipid metabolism caused by SND1 have an impact on the proliferation characteristics (growth, adhesion, migration) of cells. With this aim, gene expression analysis, lipid characterization, metabolic labelling assays, gene and protein expression analyses and enzymatic analyses were performed in SND1-overexpressing rat hepatoma cells. On the other hand, these cells were subcutaneously injected to nude mice and the development and composition of xenotumors were analyzed. SND1 overexpression alters cholesterol metabolism by overactivating the SREBP2 regulation system. The uncontrolled cholesterogenesis leads to an accumulation of cholesteryl esters. In addition, alteration in cell morphology and migration are observed and cells overexpressing SND1 show an overexpression of E-cadherin, a cell adhesion molecule dependent on membrane cholesterol composition. Tumors developed after the injection of SND1-overexpressing cells showed a higher growth rate, probably because of the overactivated cholesterogenesis and high E-cadherin expression. Last, alterations of the acylglyceride metabolism have also been observed. SND1 overexpression leads to a low triglyceride content, which seems to be a result of a limited NADPH availability for fatty acid synthesis./ SND1 proteina multifuntzionala eta ebolutiboki kontserbatua da. Bere funtzio molekular zehatzaren inguruan eztabaida dagoen arren, lan ezberdinek transkripzio genikoaren erregulazioan, RNAren metabolismoan edo lipidoen metabolismoan parte hartzen duela deskribatu dute. Bere garrantzi fisiopatologikoa aldiz argia da, izan ere minbizi ezberdinetan SND1en adierazpen maila handituta dagoela deskribatu da. Lan honen helburua, SND1ek hepatoma zelulen lipidoen metabolismoan betetzen duen funtzioa eta horrek zelulen ezaugarri morfologikoekin eta proliferatiboekin zerikusirik duen aztertzea izan zen. Horretarako, SND1 modu egonkorrean gainadierazten duten arratoiaren hepatoma zelulak erabili dira, horien lipido konposizioa, gene eta proteina adierazpena, fluxu metabolikoak eta ezaugarri morfologikoak aztertuz. Bestetik, zelula horiek nude saguetan subkutaneoki txertatuz xenotumoreen garapena eta konposizioa ere aztertu dira. SND1en gainadierazpenak kolesterolaren metabolismoaren asaldura eragiten du. SREBP2 kontrol sistema konstitutiboki aktibatuta dago eta zelulek ez dute kolesterogenesia modu egokian kontrolatzen, ondorioz kolesterolaren gainmetaketa gertatzen da kolesteril ester forman. Horrekin batera, zelulen morfologia eta migrazioa aldatuta daude eta E-kadherinaren gainadierazpena gertatzen da; mintz plasmatikoko kolesterol edukiaren menpekoa da adhesio molekulen txertaketa egokia. SND1 gainadierazten duten zelulek hazkuntza tasa altuagoko xenotumoreak sorrarazten dituzte nude saguetan, kolesterogenesi altuagoaren eta E-kadherinaren gainadierazpenaren ondorioz ziurrenik. Azkenik, azilglizeridoen metabolismoaren asaldura ere behatu da, SND1en gainadierazpenak triglizerido eduki baxuagoa eragiten du eta hori gantz-azidoen sintesirako beharrezkoa den NADPH koentzimaren eskuragarritasun baxuaren ondorio dela iradokitzen dute emaitzek.

La enfermedad celíaca (EC) es una enfermedad autoinmune que se desarrolla en personas con susceptibilidad genética. Durante la patogenia, se observa un aumento de la permeabilidad intestinal debido a una disrupción funcional de las uniones estrechas o Tight Junction (TJ). Diferentes estudios apuntan a una implicación genética de la vía TJ en la susceptibilidad a la EC. Los objetivos de esta tesis han sido, determinar la alteración de la vía en la EC, caracterizar la implicación funcional de polimorfismos en la disrupción de la barrera intestinal; y por último, crear un modelo celular para la caracterización funcional de genes candidato constitutivamente alterados en la EC. Los resultados han mostrado una alteración global de la vía a nivel de expresión, con alteraciones intrínsecas de los genes PPP2R3A, TJP1 y INADL. Además, hemos descubierto la necesidad de INADL para una adecuada proliferación y migración de las células intestinales. Por último, hemos replicado la asociación de rs6962966, y hemos descubierto que los genes contiguos están alterados en los pacientes, sugiriendo una posible implicación de la región en la patogenia. En conclusión, las alteraciones genéticas en la vía TJ en la EC podrían predisponer a los individuos susceptibles a una permeabilidad intestinal aumentada, el cual facilitaría el desarrollo de la enfermedad.

Las dinaminas clásicas son grandes GTPasas que median la fisión de la membrana durante la endocitosis. Actúan como enzimas mecano-químicas que convierten la energía obtenida de la hidrólisis del GTP en constricción y escisión del cuello de la vesícula endocítica. La unidad mínima de dinamina capaz de producir trabajo mecánico es un polímero helicoidal corto. Se cree que la hélice impone su geometría, cambiando a lo largo del ciclo de hidrólisis de GTP, sobre la bicapa lipídica. Sin embargo, aquí demostramos que la capacidad intrínseca de las dinaminas para crear la curvatura de la membrana depende en gran medida de la rigidez de la membrana. Probamos dos isoformas principales de dinaminas clásicas, Dyn1 específicas de neuronas y Dyn2 expresadas de forma ubicua, en membranas modelo con diferente rigidez a la flexión. Encontramos que la capacidad de ambas isoformas para tubular membranas planas, así como la curvatura de la membrana estacionaria impuesta por las hélices de dinamina, depende de la rigidez aparente de la membrana. La rigidez también modula la actividad mecanoquímica de ambas dinaminas. Fundamentalmente, la Dyn2 y, en menor medida, la Dyn1 podrían discriminar las diferencias moderadas de la rigidez entre las composiciones de membrana biomimética, lo que implica que la mecánica de los lípidos es un importante regulador de la maquinaria de fisión de dinamina.

Las distrofias hereditarias de la retina (DHR), son un grupo heterogéneo de enfermedades de distintos fenotipos clínicos que afectan principalmente a la retina. Existen más de 250 genes ligados a más de 20 fenotipos distintos. El avance en las técnicas de secuenciado ha permitido diagnosticar molecularmente a cada vez más pacientes, de una manera más rápida y precisa, a pesar de lo cual, el porcentaje de casos sin resolver sigue siendo alto. A lo largo de la presente tesis, nos planteamos realizar la caracterización genético-molecular de la población de pacientes con DHR de Euskadi mediante distintas técnicas y poder implementar así un flujo de trabajo para poder llevarlo a cabo. Para ello, en este trabajo hemos utilizado distintas estrategias. Por un lado, se ha utilizado la tecnología de NGS. Utilizamos dos paneles: 1) genes con herencia autosómica dominante, en el que se analizaron pacientes con sospecha de herencia dominante de forma individualizada y 2) 316 genes de diversas patologías oftalmológicas, incluidas las DHR descritas hasta el momento, en el que se analizaron muestras agrupadas en pool de pacientes con todos los tipos de herencia. También hemos secuenciado el exoma completo (WES), para detectar alteraciones en genes no asociados previamente a DHR, y arrays CGH y MLPA para detectar cambios en el número de copias, tanto de genes asociados como no asociados previamente a DHR. Con el uso de todas estas técnicas, durante esta tesis, hemos podido diagnosticar molecularmente a 61 pacientes de un total de 143 pacientes analizados.

Sarrera eta helburuak.. Munduko Osasun Erakundearen (OME) arabera, obesitatea osasun-egoeraren kontrako arriskua da, zeinak gorputzean gehiegizko gantz-pilaketa duen bereizgarritzat eta zeinaren munduko prebalentzia ia hirukoiztu egin den azken 40 urteetan, bai garatutako bai garatu-gabeko herrialdeetan. Gibeleko metabolismoaren asaldurekin lotuta dago, zeinak gibel lipidoen metaketan eta gibel koipetsuaren gaixotasun ez-alkoholikoaren (NAFLD) progresioa ahalbidetzen duten. NAFLDaren ezaugarria esteatosia edo gibel koipetsu ez-alkoholikoa da, egoera bat zeinean gibeleko TG eduki altua lipidoen pilaketan (batez ere, serumeko gantz azidoen (GA) barneratzea eta de novo lipogenesia edo DNL) eta deuseztatze bideen (batik bat, lipidoen oxidazioa edo GAOa eta dentsitate oso baxuko lipoproteinen edo VLDLren kanporaketa) arteko konpentsazio ezak bideratzen duen. Egun, NAFLDa kartzinoma hepatozelularraren (HCC) arrisku-faktore garrantzitsua da. Esteatosiaren baitan garatzen den HCCak NAFLDarekin loturiko HCCa izena du eta ezaugarri bereizgarriak ditu (lipido metaketa eta hantura, esaterako) beste etiologia batzuetatik garatutako HCCekin alderatuz gero. HCCan gene-gidari asko daude, tumore-histologiari, zelularen seinalizazio-bidezidorrei eta berprogramazio metabolikoari dagokion ezaugarri hain heterogeneoak azaltzen dituena. NAFLDarekin loturiko HCCaren fenotipoari dagokionez, nabarmentzekoa da obesitateak, berez, asaldura metabolikoak ahalbidetzen dituela, metabolikoki osasuntsua (MHO) den eta ez-osasuntsua den paziente obesoen (MUO) arteko bereizmena egiten duen sinadura metaboliko batekin erlazionatu baita. E2F trankripzio faktoreen familia, tipikoki ziklo zelularraren erregulatzailea dena, aldaketa metabolikoen arduraduna da ere, zeinak gibeleko egoera patologikoetan eta horri loturiko konplikazio metabolikoetan (obesitatea eta diabetesa, adibidez) gertatzen diren. E2F faktoreetako nahasmenduak deskribatu dira HCCan, gibeleko minbizian duten garrantzia nabarmentzen duena. Ikerketa gehienak E2F1ean oinarritzen dira, azterlanaren arabera, onkogene edo tumore-ezabatzaile moduan deskribatzen dena. E2F2aren kasuan, gehienetan E2F1aren antzekotasun funtzionalarekin erlazionatu izan da. Alabaina, hainbat ikerketek ezagutzera eman dute prozesu batzuk konpartitzen dituzten arren, funtzio batzuk batarenak edo bestearenak direla bakarrik. Ikerkuntza gehiago behar da E2F1 eta E2F2ren arteko mekanismo komunak eta propioak bereiztu ahal izateko, baita NAFLDarekin loturiko HCCan duten eragina zehazteko ere. Hori dena kontuan hartuta, proposatu genuen E2F1ak eta E2F2ak obesitateari loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran parte hartzen duten bidezidor metabolikoak erregulatzen dituztela. Testuinguru horretan, lan honen xede nagusiak izan ziren: 1) Ikertzea E2F1ak edota E2F2ak parte hartzen duten obesitarearekin loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCaren bilakaeran; 2) E2F1ak edota E2F2ak gidatzen dituzten asaldura metabolikoen mekanismoak identifikatzea NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran; 3) E2F1 eta E2F2 obesitatearekin erlazionatutako NAFLDaren biomarkatzaile goiztiar moduan baliozkotzea. Prozedura esperimentalak. Animali ereduak E2f1 knockout (E2f1-/-), E2f2 knockout (E2f2-/-) eta zegokien sagu basati (WT) (129/Sv x C57BL/6) arrak izan ziren. Gibelarentzako kartzinogenikoa den dietilnitrosamina (DEN) intraperitonealki ziztatu zitzaien jaio-osteko 14. egunean eta, titia kendu ondoren, gantzetan aberatsa den dietarekin (HFD) (DEN HFD izeneko taldea) edo oinarrizko dietarekin (DEN CD izeneko taldea) elikatu ziren sakrifikatu ziren arte 3 hilabeterekin NAFLDa ikertzeko edo 9 hilabeterekin HCCa ikertzeko. E2f1 eta E2f2 geneen gibeleko adierazpena analizatu zen gibeleko gaixotasunaren fase ezberdinetan WT saguetan. Ikerketa-talde guztietan, gorputzeko hainbat parametro eta janari kontsumoa jaso ziren, gibeleko mina neurtu zen, gibeleko eta serumeko profil lipidikoa analizatu zen, baita gibeleko histologia, fibrosi maila, ziklo zelularraren aktibazioa eta intsulinarekiko erresistentzia (IR). 9 hilabetetako E2f2-/- saguetan, gene adierazpenaren profila ebaluatu zen eta, bai 3 bai 9 hilabetetako E2f2-/- saguetan, gibeleko lipidoen hornitzean eta eliminazioan parte hartzen duten bidezidorren fluxu metabolikoak analizatu ziren baita ere. E2F1 eta E2F2 siRNA bidez isilarazi zen HepG2 giza hepatoma zelula-lerroan, triglizerido (TG) edukia eta bere sintesian eta degradazioko fluxu metabolikoak neurtzeko. Azkenik, E2F1 eta E2F2aren adierazpena ebaluatu zen pazienteen gibel-biopsietan, aurretik histologikoki gibel normala (NL) edo NAFLDa zuten taldeetan klasifikatu zirenak. Emaitzak. Gorputzeko pisuaren neurketak eta gantz ehun zuriaren (GEZ) indizeak erakutsi zuten HFD dietak obesitatea induzitu zuela 3 hilabetetako saguetan eta baldintza hori areagotu zela saguak zaharragoak ziren heinean. Bereziki, gorputz-pisuaren handitzea ez zen janari-kontsumoa areagotzearen ondoriozkoa izan. Lipido-edukiaren azterketak erakutsi zuen efektu hori gibeleko triglizerido (TG), diglizerido (DG) eta kolesteril esterren (CE) pilaketarekin bat zetorrela, hots, NAFLDaren garapenarekin. HFD elikatzeak NAFLD-HCCren bilakaera ere sustatu zuen sagu-ereduetan. Aitzitik, emaitzek erakutsi zuten DENak induzitutako HCCa ez zegoela obesitatearekin edo NAFLDaren garapenarekin lotuta. Bakarrik HFDa ematea tratamendu kartzinogenikorik txikiena izan zen, hala ere, lipidoetan aberatsa den dieta batekin elikatzeak DENak induzitutako HCCa areagotu zuen tumore kantitateari eta tamainari dagokionez. Ezaugarri histopatologikoekin bat, gibeleko lipidoen metaketa (TG eta CE moduan) nabaria zen NAFLD-HCCa garatu zuten eta DEN HFD ezarri zitzaien saguetan. Emaitzek erakutsi zutenez, E2f2ak goranzko erregulazioa izan zuen obesitatearekin loturiko NAFLD eta NAFLD-HCC garatu zuten saguetan bakarrik, E2f2 obesitatean induzitzen dela adieraziz gibeleko gaixotasunaren hasierako faseetatik. Hori gibeleko E2F1 eta E2F2ak paziente obesoetan zuten adierazpen areagotuarekin erlazionatzen da, gibeleko gaixotasuna ez zutenean ere ematen den egoera. Horrela, E2F1 eta E2F2ak gibeleko gaixotasunaren iragarletzat duten balioa aditzera ematen da. Nabarmenki, E2F2aren gainadierazpena oraindik handiagoa izan zen behin NAFLDa garatuta zegoela paziente obesoetan, zeinak MUO bezala sailkatzeko irizpideak betetzen zituzten eta beraz, MUO pazienteak E2F2 edukiaren bidez ezberdintzea baimenduko luke. E2f1 eta E2f2ak obesitatearekin loturiko gibelaren gaixotasunean eginkizun bat zutela zehaztu ondoren (E2F1 eta E2F2aren mailak paziente obesoen eta saguen egoera metabolikoan zuten efektuaren bidez), E2f1 eta E2f2aren zereginak ikertu ziren NAFLDaren eta NAFLD-HCCaren agerpenean eta bilakaeran. E2f1-/- eta bereziki E2f2-/- saguek tratamendu guztiengatik induzitutako tumoreen garapena ia guztiz ekidin zutela behatu genuen, E2f1 eta, batik bat, E2f2ren absentziak tratamenduek induzitutako hepatokartzinogenesiarekiko babesa ematen dutela adieraziz. Analisi histokimikoak eta lipidoen kuantifikazioak frogatu zutenez, E2f1 eta E2f2aren faltak gibeleko lipidoen metaketa ekidin zuen HCC induzitzeko tratamenduei erantzunez. Antzeko profil metabolikoa nabarmendu zen giza-HCCaren zelula lerroetan E2F2 isilarazi zenean, baina ez E2F1 isilaraztean. E2f1 eta bereziki E2f2ren defizientziak 3 hilabetetan garatutako hepatoesteatositik babestu zituen saguak baita ere, ziklo zelularra aktibo ez zegoenean, E2f1 eta E2f2ren eginkizun metabolikoa aditzera ematen duena. NAFLD aurrerakoiaren prebentzioarekin bat, gene adierazpenak eta analisi histokimikoak jakinarazi zuten E2f1 eta E2f2ren absentziak eragozten zituela bai Tfgb1-bidezko fibrosia bai Il1b-bidezko hantura, zeinak obesitatearekin loturiko NAFLD eta NAFLD HCCaren azterketa-ereduetan nabarmen ziren. E2f2ren parte-hartzea obesitatearekin loturiko gibel-gaixotasunaren garapenean E2f1arena baino garrantzitsuagoa izan zen, beraz, E2f2ren absentziak zuen NAFLD-HCCa garatzeko erresistentziarekin loturiko transkripzio-programa ikertu genuen. Bertatik ezagutu genuen esanguratsuki gehien gainadierazi ziren geneak lipidoen katabolismoan eta energia ekoizpenean taldekatzen zirela, HCCan tipikoki induzitzen diren bidezidorrak hain zuzen ere. Bestalde, beheranzko adierazpena zuten locusak ziklo zelularrarekin, apoptosiarekin eta lipidoen sintesiarekin erlazionatzen ziren. Hori guztia bat dator E2f2ren absentziak NAFLDa eta erlazionatutako HCCa ez garatzeko saguetan ematen duen babesarekin. Mikroarrayeko datuetan oinarrituz, gibeleko lipidoen sustatzean eta irteeran jarduten duten bidezidorrak analizatu ziren. Lipidoen deuseztatze-bideei dagokienez, E2F2ren defizientzia GAen oxidazio (GAO) maila altuekin erlazionatu zen giza-tumore zeluletan eta saguen gibeletan, ß-oxidazioaren erreakzioetako eta GAen aktibazioko geneen handitutako adierazpenarekin batera. Bereziki, GAOren pausu mugatzailean parte hartzen duen eta obesitatean hepatokartzinogenesiaren sustatzaile den CTP2 gene eta proteinaren adierazpenak beheranzko erregulazioa zuen NAFLD eta NAFLD-HCCaren sagu-ereduetan eta goranzko erregulazioa zuen E2f2 defizientea zenean. Gainera, NAFLDan eta NAFLD-HCCan gertatzen denaren kontrara, E2f2ren absentzia HNF4-¿-ren gainadierazpenarekin erlazionatuta zegoen, hartzaile nuklear bat zeina GAOa eragiten duen eta HCCaren inhibizioan zeregin bat duen. Hortaz, emaitzek iradokitzen dute E2f2ak gibel-gaixotasuna garatzetik eskaintzen duen babesean jarduten duen mekanismo nagusietako bat areagotutako GAOa dela, zeina handitutako mitokondrioarekiko GAen garraioaren bidez ematen den. Zelulek ATP gehiago behar izatekotan, GAOtik eta azido trikarboxilikoaren ziklotik (ATZ) eskuratutako ahalmen erreduzitzailea fosforilazio oxidatzailera (oxphos) bideratzen da. Prozesu horrekin erlazionatutako hainbat genek adierazpen baxua zutela behatu genuen obesitatearekin lotutako HCCan eta induzituta zeudela E2f2an defizienteak ziren saguen gibeletan. Oxphosa gidatzen duen eta obesitateak induzitutako esteatosia erregulatzen duen PGC-1ß-ren adierazpen patroia antzekoa zen. Lipidoen hornitze bideei dagokionez, [3H]-glizerolaren eta GAen esterifikazioaren emendapenak, PPAR-¿ gene eta proteinaren baita lipidoen garraioan eta biltzean jarduten duten bere itu geneen gainadierazpenarekin batera, adierazten dute TGaren biosintesia NAFLDa eta HCCarekiko bilakaera sustatzen duen beste mekanismo bat dela. DEN HFD tratamendua ezarritako E2f2 gabeko saguen gibeletan, parametro guzti horiek gutxiegituta zeuden, iradokitzen duenak E2f2ren absentziak tratamenduak induzitutako lipogenesia galarazten duela. [3H]-azetatoarekin ebaluatutako TGaren de novo lipogenesia (DNL) ez zegoen aldatuta DEN HFD ezarritako E2f2-/- saguetan, E2f2ren faltarekin erlazionatutako TGaren biosintesi murriztua esterifikazioaren asalduragatik izan zela adieraziz eta ez DNL gutxiagotzeagatik. Emaitzek iradoki zuten dislipemiak garrantzia handia zuela NAFLDan eta HCCarekiko bere bilakaeran, izan ere, TG eta GA serikoen maila handiagotua zegoen DEN HFD ezarritako saguetan. Aitzitik, dislipemia ez zuen VLDLren gibeleko kanporaketaren asaldurak eragin, gibeleko VLDL jariapena baita Apob eta Apoeren adierazpenak aldatu gabe mantendu zirelako. GEZaren lipolisia, energia premian gibelaren eta gantz-ehunak ez direnen GA hornitzailea, ez zen parte-hartzen zuen bidezidorra ezta ere, GEZaren indizea handituta baitzegoen obesitatearekin loturiko NAFLDa zuten WT saguetan kontrolekin alderatuz gero. NAFLD eta NAFLD-HCCa garatu zuten saguetan serumeko lipido-profila asaldatuta egon arren, goratutako Lpl adierazpenak iradokitzen du serumeko TGaren gibeleko katabolismoa handituta zegoela, gibelean lipido metaketa eta HCCa garatzea ahalbidetzen duen egoera. E2F2ren zereginari dagokionez, emaitzek adierazten dute E2f2ren absentziak saguak dislipemiatik eta odol-TGaren gibeleko ezabatzetik babesten dituela. Izan ere, GA eta TG serikoen maila ez zen altua baldintza proesteatotikoak ezarritako E2f2-/- saguetan, nahiz eta GEZaren lipolisia handituta egon, GEZ indizea txikiagotua eta gibeleko Lpl adierazpenaren erregulazioa baxuagoa izan. Orohar, gibeleko GAOa, lipidoen sintesia eta TGen xurgapena, obesitatearekin loturiko HCCan nahasita dauden bidezidorrak dira eta asaldatuta daude gibeleko gaixotasunaren fase goiztiarretan baita ere, E2F2 gainadierazita dagoen egoera hain zuzen. Jakinik E2f2ren ezabatzeak NAFLD aurrerakoiarekin erlazionatutako profil metabolikotik saguak babesten zituela, iradokitzen dugu E2F2ak NAFLDari loturiko HCCa baino lehenago gertatzen den metabolismoaren moldaketa gidatzen duela. Aurkikuntza honen garrantzia E2F2 obesitatearekin erlazionatutako gibel-gaixotasunaren biomarkatzaile goiztiarra izatean datza. Azkenik, obesitatearen eta NAFLDaren konplikazio metabolikoek II motako diabetes mellitusa (IIMDM) barruan hartzen dute, zeina intsulinarekiko erresistentziatik (IR) eratortzen den eta NAFLD pazienteetan HCCa pairatzeko arriskua handitzen duen egoera. Gainera, jadanik deskribatuta dago E2F1ak glukosaren homeostasia mantentzean eta diabetesa ekiditean jarduten duela. Beraz, jakin nahi izan genuen NAFLDaren fase goiztiarrean eta HCCrako bilakaerak IRa ahalbidetzen bazuen eta E2f1 edota E2f2ak horretan zereginik bazuten. Dagokien tolerantzia testek erakutsi zuten IRa garatu zela DENarekin konbinaturiko edo ez konbinaturiko HFD dieta laburra ezartzeagatik NAFLDa zuten WT sagu obesoetan, dietak-induzitutako egoera dela adieraziz. E2f1 eta E2f2ren absentziak NAFLDa induzitzeko tratamentuari loturiko IRa garatzea saihestu zuten saguetan, baina ez NAFLD-HCCa induzitzeko tratamenduari erlazionaturikoa. Ondorioak 1. E2F1 eta, bereziki, E2F2 transkripzio faktoreek obesitateari loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran jarduten dute. 1.1. Bai E2F1 bai E2F2 gainadierazita daude NAFLDa duten paziente obesoetan eta E2f2 gainadierazita dago baita ere obesitatearekin erlazionatutako NAFLDaren eta NAFLDari loturiko HCCaren sagu-ereduetan, zeinak transkripzio faktore hauek proesteatotikoak eta onkogenikoak direla iradokitzen duen. 1.2. E2f1 eta, batik bat, E2f2aren absentziak obesitatearekin loturiko NAFLDaren garapena prebenitzen du. E2f1 edo E2f2 faltan duten saguek ez dute hepatoesteatosirik ezta NAFLDren indukzio-tratamenduek eragindako gibel-hanturarik, transkripzio faktore hauek obesitatearekin lotutako NAFLDan premiazkoak direla erakutsiz. 1.3. E2f1 eta E2f2aren defizientziak erresistentzia ematen du NAFLDarekin loturiko HCCarekiko eta horrekin erlazionatutako fibrosiarekiko eta lipido metaketarekiko, bai E2f1 bai E2f2a prozesu horietan beharrezkoak direla adieraziz. 2. E2f2 transkripzio faktoreak obesitatearekin loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCarekiko bilakaeran ematen den berprogramazio metabolikoa koordinatzen du. 2.1. E2f2ak gibeleko lipido-biltegiratzean ekiten duten bidezidor metabolikoak kontrolatzen ditu gibel-gaixotasunaren fase goiztiarretik. Babes mekanismo bezala, saguetako E2f2aren defizientziak NAFLD eta NAFLD-HCCarekin lotutako dislipemia eta areagotutako TGen sintesia baita xurgapena saihesten ditu. Bestalde, handitutako GAOak NAFLDarekiko eta HCCarekiko erresistentzia ahalbidetzen du E2f2 knockout saguetan, areagotutako mitokondrioarekiko GAen garraioaren bidez. 2.2. Profil lipidikoa hobetzeaz gain, E2f2aren defizientziak obesitatearekin lotutako NAFLDaren fase goiztiarretako IRa prebenitzen du saguetan, baina ez NAFLD-HCCarekin erlazionaturikoa. 3. E2F1 eta, batez ere, E2F2a obesitatearekin lotutako NAFLDaren markatzaile prognostiko eta potentzialak dira. E2F1 eta E2F2 NAFLDa duen ala ez duen obesitatean induzitzen dira. Gainera, gibeleko E2F2 edukiaren handitzea oraindik ere nabarmenagoa da NAFLD garatzen denean.

La tirosinemia hereditaria tipo I es un trastorno autosómico recesivo causado por la deficiencia de la enzima fumarolacetoacetato hidrolasa (FAH). La deficiencia de FAH conduce a la acumulación celular de metabolitos tóxicos que incluyen principalmente, succinilacetona (SA), maleylacetoacetate (MAA) y fumarylacetoacetate (FAA) en muchos tejidos corporales. El hígado y el riñón son los dos órganos más afectados por este trastorno, y el desarrollo del carcinoma hepatocelular es el síntoma principal. En este proyecto, hemos investigado biofísica y bioquímicamente el papel de la estabilidad en la proteína WT FAH junto con un conjunto representativo de 19 mutaciones missense encontradas en pacientes con HT1. Nuestros hallazgos indican que tanto la estabilidad termodinámica como la cinética juegan un papel clave en las enfermedades. Asimismo, esta información mecanística allana el camino para el desarrollo de nuevas terapias basadas en la estrategia de chaperonas farmacológicas para hacer frente a esta grave enfermedad. Además, a través de varios cribados, hemos identificado 17 moléculas pequeñas que son capaces de modular la actividad catalítica de la enzima FAH.

Los recursos genómicos y las herramientas bioinformáticas son muy escasas en especies no modelo. El RNA-Seq puede ser una herramienta efectiva para generar tales recursos genómicos con el objetivo de revelar la variación genética y funciones necesarias en estudios micro- y macro-evolutivos. La primera sección de esta Tesis aborda la presencia o ausencia de los filogrupos Este y Oeste de dos poblaciones cultivadas de Tinca tinca en Europa Central. Nuestro estudio respalda la hipótesis de que los individuos analizados resultan ser un mosaico genómico de ambos filogrupos, y que las diferencias entre las dos razas se deben a la composición inicial de los filogrupos en el momento de su fundación. La segunda sección de esta Tesis describe EXFI, un método que utiliza algoritmos de última generación para dividir tránscritos en exones. La tercera sección muestra un método de muestreo optimizado para la caracterización de tránscritos. Apliqué la estrategia multi-tejido para obtener muestras, secuenciar y ensamblar el transcriptoma más exhaustivo de la sardina europea. En la última sección, estudié las relaciones evolutivas dentro de los Clupeiformes. Recopilé un gran conjunto de transcriptomas de doce especies, construí su árbol filogenético, y descubrí grupos de genes bajo selección positiva. La principal conclusión es que la evolución ha moldeado la maquinaria molecular de los Clupeiformes hacia un almacenamiento y transporte de lípidos mejorado.

Los virus filamentosos flexibles constituyen uno de los mayores grupos de patógenos de plantas con un impacto en la agricultura muy relevante. Estos virus con genoma (+)ssRNA presentan viriones filamentosos flexibles con estructura helicoidal. En este trabajo hemos determinado la estructura a alta resolución del virión de un miembro de este grupo, el Virus del mosaico de la sandía (WMV) (familia Potyviridae) por crio-microscopía electrónica. La estructura obtenida para la proteína de la cápsida (CP) de WMV muestra un plegamiento muy similar a los miembros con estructura disponible de la familia Alphaflexiviridae y revelan un sitio de unión al RNA genómico del virus idéntico en ambas familias. El análisis de las secuencias consenso para las CPs de las distintas familias de virus filamentosos flexibles muestra la existencia de tres residuos conservados en la zona de unión con el RNA. Conjuntamente, estos resultados indican un plegamiento común para las CP de las distintas familias de este grupo de virus y la existencia de una diana para el diseño de compuestos antivirales. Anteriormente se había descrito la similitud estructural entre las CPs de los miembros descritos de la familia Alphaflexiviridae y algunas nucleoproteínas (NP) de virus ssRNA que infectan animales (gen. Phlebovirus). La CP de WMV también presenta homología estructural con las nucleoproteínas de estos virus pero además también con las NPs de miembros de la familia Orthomyxoviridae. Estos resultados sugieren la existencia de una relación evolutiva entre los virus filamentosos flexibles (+)ssRNA y los virus (-)ssRNA patógenos de animales y plantas.

La porfiria eritropoyética congénita es una enfermedad rara autosómica recesiva producida por una actividad deficiente en la uroporfirinógeno III sintasa, la cuarta enzima de la ruta biosintética del grupo hemo. La enfermedad afecta a diversos órganos, llegando a ser potencialmente peligroso para la vida, careciendo actualmente de tratamientos curativos. Bioquímicamente, las mutaciones hereditarias de mayor frecuencia reducen la estabilidad del enzima, alterando su homeostasis, que, en última instancia, reducen la producción de grupo hemo intracelular. Esto da como resultado la acumulación de subproductos de uroporfirina que se distribuyen y depositan por todos los tejidos, agravando la patología con síntomas tales como fotosensibilidad de la piel y lesiones cutáneas fototóxicas desfigurantes. En el presente trabajo, demostramos como el sintético antifúngico y microbiano fármaco comercial denominado ciclopirox, se asocia al enzima estabilizándolo. Ciclopirox asiste al enzima mediante unión alostética, distante del centro activo, sin afectar, por tanto, a su función catalítica. El fármaco es capaz de reestablecer la actividad in vitro, in cellula e in vivo, llegando incluso a aliviar la mayoría de los síntomas clínicos en un modelo de ratón bona fide de la enfermedad, actuando a concentraciones sub-tóxicas, estableciendo una nueva línea de intervención terapéutica contra la porfiria eritropoyética congénita. Aplicable a la mayoría de las mutaciones sin sentido perjudiciales que causan esta devastadora enfermedad.

Mice are widely used in research. This animal species has also been extensively used to study the relationship between ticks and their mammalian hosts, including the design and test of vaccine candidates, although it is believed that mice do not develop tick immunity. We have established a test system in order to assess protection against tick feeding using this small animal model. We have redesigned containment capsules and tested the use of tissue cement to attach them to the shaved skin of the mice. Our results provide both an improved capsule design and permanent and strong bonding capabilities of the tissue cement. We then assessed the protective capacity of different immunization strategies, both active and passive, against an array of antigens and tissue extracts. We therefore tested active immunization with tick Histamine Release Factor (tHRF), as well as passive transfer of both human and bovine sera against whole tick, midgut or salivary gland extracts. We found that none of the strategies utilized elicited strong and consistent effects on different parameters of tick feeding, such as attachment time, weight at detachment or molting efficiency. These results suggest that, at least for the European tick, Ixodes ricinus, mice are not in general a suitable model to test anti-tick vaccines. On the other hand, in order to identify tick antigens as potential targets for the development of a tick vaccine, salivary gland and midgut extracts were immunoprecipitated with immune antisera raised in cows that had shown protective effects against tick feeding in these animals. We identified antigen with putative metalloprotease, integrin and Apple domain-containing proteins that could function to prevent blood coagulation. Our identification was validated with the protein annotated as I. ricinus A0A0K8RQF1, which shares homology with Toll-like receptors and could form part of the immune response of ticks. This antigen, which is differentially recognized by protective anti-tick sera could alone or in combination protect against tick feeding in species such as cows and perhaps humans, and provide the basis for a new anti-tick vaccine. Salp15, a salivary protein of Ixodes ticks, inhibits the activation of naïve CD4 T cells. Treatment with Salp15 results in the inhibition of early signaling events and the xxx vi production of the autocrine growth factor, interleukin-2. The fate of the CD4 T cells activated in the presence of Salp15 or its long-term effects are, however, unknown. We now show that Salp15 binding to CD4 is persistent and induces a long-lasting immunomodulatory effect. The activity of Salp15 results in sustained diminished crossantigenic antibody production even after interruption of the treatment with the protein. Transcriptionally, the salivary protein provokes an acute effect that includes known activation markers, such as Il2 or Cd44, and that fades over time. The long-term effects exerted by Salp15 do not involve the induction of either anergy traits nor increased populations of regulatory T cells. Similarly, the treatment with Salp15 does not result in B cell anergy or the generation of myeloid suppressor cells. However, Salp15 induces the increased expression of the ectoenzyme, CD73, in regulatory T cells and increased production of adenosine. Our study provides a profound characterization of the immunomodulatory activity of Salp15 and suggest that its long-term effects are due to the specific regulation of CD73. xxxvii RESUMEN El modelo de ratón ha sido ampliamente usado en investigación. Esta especie animal ha sido también ampliamente usada para estudiar las relaciones entre las garrapatas y sus huéspedes mamíferos, incluyendo el diseño y evaluación de antígenos para el desarrollo de vacunas, a pesar de la creencia de que los ratones no desarrollan inmunidad frente a garrapatas. En nuestro grupo, hemos establecido un sistema con el fin de poder evaluar la protección frente a la alimentación de las garrapatas usando este modelo animal. Hemos rediseñado capsulas de contención y puesto a prueba el uso de pegamento tisular para fijar las capsulas a la piel del ratón. Nuestros resultados proporcionan tanto un diseño mejorado de la capsula de contención como una fuerte capacidad de adhesión y duración por parte del pegamento tisular. De esta manera, evaluamos la capacidad protectora de las diferentes estrategias de inmunización, tanto activa como pasiva, frente a una variedad de antígenos y extractos tisulares de garrapata. Asimismo, evaluamos la inmunización activa con el Factor de Liberación de Histamina, así como la transferencia pasiva de sueros tanto humanos como bovinos frente a extractos de garrapata total, estomago o glándula salivar. Los resultados mostraron que ninguna de las estrategias utilizadas provocó efectos sólidos y consistentes en cuanto a parámetros relacionados con la alimentación de garrapatas, tales como el tiempo de adhesión al huésped, el peso a la hora de su desprendimiento o la eficiencia en la muda. Estos resultados sugieren que, al menos para la garrapata europea, Ixodes ricinus, el modelo de ratón no es un modelo apropiado para el diseño y estudio de vacunas anti-garrapatas. Por otra parte, con el fin de identificar antígenos de garrapatas como dianas potenciales para el desarrollo de una vacuna, extractos de glándula salivar y estómago fueron inmunoprecipitados con suero inmune elaborado en vacas que previamente mostraron efectos protectores frente a su alimentación en estos animales. De esta forma, identificamos antígenos tales como metaloproteasas, integrinas y proteínas con dominios Apple que podrían actuar previniendo la coagulación de la sangre. Nuestra identificación fue validada con la proteína anotada como I. ricinus A0A0K8RQF1, que comparte homología con los receptores Toll y podría formar parte de la respuesta inmune de las garrapatas. Este antígeno, diferencialmente reconocido por el suero inmune contra garrapatas, podría, o bien sólo o bien en combinación con otros antígenos, proteger contra xxx viii la alimentación de garrapatas en especies tales como vacas y tal vez humanos, y proporcionar, a su vez, la base para una nueva vacuna frente a estos parásitos. Salp15, una proteína de la saliva de garrapatas del genero Ixodes, inhibe la activación de las células CD4 T. El tratamiento con Salp15 resulta en la inhibición de eventos de señalización celular tempranos y de la producción del factor de crecimiento autocrino, interleuquina-2. El destino de las células CD4 T activadas en presencia de Salp15 o sus efectoras a largo plazo son, sin embargo, desconocidos. En este estudio mostramos que la unión de Salp15 a CD4 es persistente e induce un efecto inmunomodulatorio de larga duración. La actividad de Salp15 provoca una producción reducida de anticuerpos frente a antígenos cruzados que es prolongado en el tiempo, incluso después de la interrupción del tratamiento con Salp15. A nivel transcripcional, la proteína salivar provoca un efecto agudo en la transcripción de varios genes que incluyen marcadores de activación, tales como Il2 o Cd44, y que se desvanece con el tiempo. Los efectos a largo plazo ejercidos por Salp15 no involucran la inducción de marcadores de anergia ni el aumento de la población de células T reguladoras. Similarmente, el tratamiento con Salp15 no resulta en la generación de células B anergicas o de células mieloides supresoras. Sin embargo, Salp15 induce un incremento en la expresión de la ectoenzima, CD73, en las células T reguladoras y un aumento en la producción de adenosina. Nuestro estudio proporciona una caracterización profunda de la actividad inmunomodulatoria de Salp15 y sugiere que su efecto a largo plazo es debido a la regulación específica de CD73.

El estudio de la biodiversidad de las comunidades de plancton de los estuarios resulta de gran interés debido a que son parte fundamental de las cadenas tróficas acuáticas y a su capacidad de responder relativamente rápido ante cambios ambientales. Esta última característica sobretodo resulta de gran utilidad para la evaluación del estado de dichos ecosistemas ya que normalmente se encuentran sometidos a una gran presión antropogénica; es por ello que esta tesis se centra concretamente en la estuario de Bilbao, que llegó a ser uno de los más contaminados de España debido a la industrialización y creciente población de la ciudad. Debido a la mayor sensibilidad y resolución del metabarcoding, el objetivo principal de este trabajo es por tanto la de realizar una caracterización completa de la comunidad planctónica eucariota de este estuario, así como determinar tanto los patrones espaciales como temporales que la influencian. Con ello pretendemos conocer la composición taxonómica y abundancias relativas de dichas comunidades y, además, evaluar la adecuación del metabarcoding para la detección de alteraciones de esta comunidad, y como tal, su posible utilidad como herramienta rutinaria de monitoreo en la ría de Bilbao.

Planktonic communities are widely used as indicators of water pollution level, as they are vulnerable to water quality status. Indeed, it has been proposed that estuaries microbial composition changes during eutrophication period due to the increase of pollutants and hypoxia. In the present study, we characterized the bacterial community structure of two macro-mesotidal estuaries by sequencing the V4 region of the 16s rDNA gene. While Bilbao estuary crosses a densely populated urban area, the Urdaibai estuary is an UNESCO biosphere reserve. Results evidenced that the bacterial species composition and abundance of both estuaries significantly differed between the inner and outer water masses. Moreover, seasonal effects on community structure were detectable in the inner zones of both estuaries, but only minor variation were found in the outer waters, presumably due to a more stable physicochemical environment common in open sea waters. In fact, community structure significantly differed in this period, suggesting a low turnover time for inner water mass in this estuary. Moreover, it has been observed that the bacterial metabolism is different in each of water mass, especially in the mass of eutrophic water and in the waters around the WWTP of Bilbao.

Las células ¿natural killer¿ (NK) son un componente clave del Sistema Inmunitario y juegan un papel fundamental en la defensa frente a infecciones virales y células cancerígenas. Una breve estimulación con interleuquina (IL)-12, IL-15 e IL-18 confiere a las células NK unas propiedades similares a las de la memoria inmunológica. Estas células NK con propiedades tipo memoria son conocidas como cytokine-induced memory-like (CIML) tienen una actividad antitumoral superior y han demostrado ser capaces de combatir eficazmente diferentes cánceres en modelos de ratón. Además, las células NK CIML se están probando en 10 ensayos clínicos y están mostrando resultados muy prometedores. Dada la relevancia terapéutica de estas células NK estimuladas con IL-12/15/18, el objetivo de esta tesis es estudiar el efecto de estas IL sobre diferentes aspectos de las células NK, incluyendo el fenotipo, funciones efectoras, metabolismo y la dinámica mitocondrial. Nuestros datos han mostrado cómo la estimulación con IL-12/15/18 incrementa la capacidad citotóxica y la polifuncionalidad de las células NK, y les confiere la capacidad de proliferar en respuesta a dosis bajas de IL-2. También describimos cómo la estimulación con IL-12/15/18 induce una reprogramación metabólica de las células NK, y la relevancia de algunas rutas metabólicas para las funciones efectoras de estas células. Por último, estudiamos los cambios que induce la estimulación con IL-12/15/18 sobre las mitocondrias de las células NK y la relación que tienen con su viabilidad.

El paisaje de epigenético Waddington surge inicialmente en 1957 como una metáfora del proceso de desarrollo de embriones a organismos enteros. En esta metáfora el desarrollo embrionario es una bola que desciende desde las partes más altas (más indiferenciado) hasta los valles (más diferenciado) siguiendo un determinado recorrido. Esta idea está siendo revisitada en los últimos años y su construcción puede acercarnos a un mejor entendimiento de los procesos de diferenciación. En la presente tesis se ha realizado la construcción del paisaje de Waddington a partir de datos transcriptómicos disponibles en repositorios públicos. El primer paso ha sido el desarrollo de un software para el alineamiento y fusión de ontologías, con el objetivo de conseguir un estándar de los diferentes tipos celulares del organismo y sus relaciones de diferenciación. Con esta ontología se ha desarrollado una serie de algoritmos para el etiquetado y descarga de muestras en el repositorio de GEO. A continuación, con las muestras etiquetadas y la ontología de desarrollo se ha elaborado un algoritmo genético que seleccione un conjunto de genes que construyan el paisaje de Waddington. Finalmente, se analizó este conjunto de genes mediante un GO y se comparó con huellas genéticas de diferentes tipos celulares, obteniéndose resultados significativos para células del sistema inmune y para procesos metabólicos e inmunes.

El objetivo general de la presente tesis se ha centrado en la monitorización de modelos celulares mediante la técnica de espectroscopia de Raman aumentada en superficies (SERS). Las tecnologías desarrolladas en la tesis han perseguido, por un lado, mejorar la recreación del ambiente tumoral a escala de laboratorio, y por otra parte, su integración junto con estructuras plasmónicas para el análisis por SERS de los modelos tumorales creados artificialmente. Más en concreto, se han analizado las alteraciones en la concentración relativa de los metabolitos presentes en el medio extracelular como resultado de la reprogramación metabólica característica de los tumores, la cual permite a su vez un crecimiento descontrolado de dichas células. La disposición conjunta de ambas tecnologías (cultivos celulares en 3D y nanoplasmónica) ofrece un marco único para la identificación de aquellos procesos celulares que se encuentran alterados durante el crecimiento de tumores. Hasta la fecha, la mayoría de las técnicas de laboratorio que se habían empleado para caracterizar ambientes celulares en el laboratorio implicaban procesos invasivos, es decir, que modifican o incluso desintegraban la muestra para poder analizarla. En contraposición, la espectroscopia Raman había permitido adquirir información sobre la composición del medio celular de una manera mínimamente invasiva. Basada en los fenómenos de dispersión inelástica, la técnica de Raman emplea luz monocromática (generalmente de un láser) para irradiar la muestra bajo análisis, de forma que la interacción entre la muestra y el láser provoca un cambio en la energía de los fotones dispersados, específico de los modos vibraciones de las moléculas irradiadas. Por lo tanto, la luz dispersada y recogida por un detector, permite caracterizar el sistema biológico que ha sido previamente iluminado, sin marcaje previo. Sin embargo, las señales detectadas por dispersión Raman son de manera general muy débiles, por lo que se requiere una intensificación de dichas señales para poder detectar la presencia de metabolitos extracelulares (a bajas concentraciones). En esta tesis se decidió implantar la modalidad conocida como SERS, que hace uso de las propiedades plasmónicas de nanopartículas metálicas (principalmente de oro), las cuales dan lugar a campos eléctricos elevados cuando se iluminan en resonancia con los plasmones superficiales. Como resultado, la señal de Raman de las moléculas adsorbidas sobre dichas superficies metálicas se ve amplificada en varios órdenes de magnitud. Sobre esta base, se han desarrollado en la tesis diferentes plataformas destinadas a combinar sustratos plasmónicos, formados por fijación de nanopartículas de oro sobre estructuras rígidas en 2D, o bien embebidas en redes poliméricas, junto con modelos de células tumorales en crecimiento. La finalidad de la tesis ha sido pues, la monitorización de diferentes procesos celulares en dichos dispositivos mediante SERS, y su posterior interpretación biológica en el ámbito del metabolismo tumoral y la mejora del tratamiento.

Non-coding RNAs (ncRNAs) are involved in several biological processes in mammals, including the immune system response to pathogens and vaccines. The annotation and functional characterization of two of the main classes of ncRNAs, microRNAs (miRNAs) and long non-coding RNAs (lncRNAs), is more advanced in humans than in livestock species, and thus, there is limited knowledge about the function of these transcripts. The main objective of this work was the identification of ovine non-coding genes, concretely miRNA and lncRNA genes, that are involved in the innate and adaptive immune responses induced by vaccines, vaccine components and pathogen infections. For this purpose, high-throughput transcriptome sequencing datasets produced for this purpose and datasets publicly available were analysed with bioinformatic tools and workflows in order to identify unannotated non-coding genes, profile their expression in different tissues and perform evolutionary conservation analyses. More than 12000 unannotated ovine lncRNAs and 1000 ovine miRNAs were identified in the different analyses, with varying levels of sequence conservation. Differential expression analyses between unstimulated samples and samples stimulated with pathogen infection or vaccination resulted in hundreds of lncRNAs and miRNAs with changed expression. Gene co-expression analyses revealed immune gene-enriched clusters associated with immune system activation. These genes make up a prioritized set of potential candidates for deeper experimental analyses. Taken together, these results should help completing the sheep non-coding gene catalogue, and most importantly, they give evidence of immune state-specific ncRNA expression patterns in a livestock species.

El gen PTEN es uno de los supresores tumorales más importantes junto a p53. PTEN antagoniza directamente la ruta de señalización oncogénica de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), ruta involucrada en procesos celulares como el crecimiento, la proliferación, la supervivencia y el metabolismo celular. Se han encontrado mutaciones patogénicas a lo largo de todo el gen PTEN. Las mutaciones predominantes son las mutaciones missense y nonsense, representando un 40% y 17% de todas ellas, respectivamente. Las mutaciones nonsense estás asociadas a enfermedades genéticas hereditarias, las cuales generan un codón de terminación prematura (PTC) provocando una truncación patogénica de la proteína. PTEN presenta mutaciones germinales de pacientes con síndromes de cáncer hereditario (también denominado síndrome de hamartoma tumoral de PTEN, PHTS), y en individuos que manifiestan fenotipos no cancerígenos, los cuales desarrollan macrocefalia, retardo en el desarrollo y desordenes del espectro autista (Autism Spectrum Disorder, ASD). En esta tesis doctoral, primero se ha optimizado la metodología de mutagénesis dirigida para poder generar de forma eficaz y rápida mutaciones hereditarias del gen PTEN encontradas en pacientes con ASD y PHTS, así como de PTCs de PTEN. En segundo lugar, hemos caracterizado funcionalmente las variantes hereditarias asociadas a ASD y PHTS, y hemos investigado el potencial terapéutico de estas mutaciones basadas en la función de PTEN y PTEN-L, una nueva isoforma de PTEN que posse una traducción de la proteína más estable. Se ha observado que casi todas las mutaciones de la región N-terminal de PTEN encontradas en pacientes con ASD son inactivas en PTEN, sin embargo, son capaces de recuperar la actividad en PTEN-L. Estos resultados abren la posibilidad de utilizar terapias basadas en PTEN para este grupo de pacientes. Por último, se ha determinado el patrón de respuesta del readthrough (RT o ¿lectura a través¿) de mutaciones PTCs de PTEN identificadas en tumores humanos. Se ha realizado un análisis para determinar aquellos PTCs capaces de hacer readthrough en presencia de geneticina (G418), un antibiótico capaz de inducir readthrough y generar proteínas completas de genes con PTCs, además de analizar la funcionalidad de la proteína generada. Los resultados obtenidos indican la existencia de un patrón heterogéneo de la respuesta del readthrough de los diferentes PTCs de PTEN. Nuestro análisis puede contribuir a la determinación de qué pacientes poseen una mayor probabilidad de beneficiarse de un posible tratamiento de precisión.

Las mutaciones sin sentido generan codones de terminación prematura (PTC) y son alteraciones genéticas frecuentes en cáncer y en enfermedad. Las proteoformas que surgen de estas variantes de PTC suelen ser menos estables y muestran una función proteica disminuida. En esta tesis doctoral, se ha estudiado in silico la distribución de PTC asociada a cáncer y la influencia del reinicio de traducción mediado por mutaciones sin sentido en genes supresores tumorales de forma global. Hemos descrito y caracterizado a nivel molecular una nueva proteoforma de PTEN derivada del reinicio de traducción a partir de la Met35 que hemos designado PTEN M35. Igualmente, hemos descubierto que la isoforma corta de VHL pVHL19 se genera a través del reinicio de traducción mediado por mutaciones sin sentido en la Met54. Además, esta tesis a demostrado que el reinicio de traducción mediado por mutaciones sin sentido tiene lugar en MMADHC en la Met62 y la Met116. Por último, para variantes de los tres genes estudiados con mutaciones PTC, se ha realizado un estudio de reconstitución de la biosíntesis de la proteína mediante readthrough (lectura a través) traduccional, utilizando principalmente el aminoglucósido geneticina (G418) como inductor. Los resultados de esta tesis indican que PTC en PTEN, VHL y MMADHC son susceptibles a reconstitución mediante readthrough, y que dicha reconstitución depende de la naturaleza del PTC, el contexto nucleotídico y la expresión basal de la proteína.

Esta tesis doctoral se basa en la descripción de los mecanismos moleculares que activan la migración y fagocitosis de la microglía en respuesta al péptido ß-amiloide, característico de la enfermedad de Alzheimer. Nuestros resultados han demostrado que el ß-amiloide se une al receptor integrina ß-1 en la línea inmortalizada de microglía humana para activar posteriormente a la GTPasa Rac1. Rac1, entonces, activa específicamente la isoforma muscular de la glucógeno fosforilasa (PYGM), la cual también se expresa en células del sistema nervioso central. La activación de la PYGM induce la liberación de monómeros de glucosa-1-fosfato (G1P) desde los gránulos de glucógeno. En presencia del péptido ß-amiloide, la G1P liberada del glucógeno es utilizada en la ruta biosintética de las hexosaminas, cuyo último producto es el UDP-GlcNAc. El UDP-GlcNAc es el sustrato de la O-GlcNAc transferasa (OGT), enzima que se encarga de O-GlcNAcilar proteínas nucleocitoplasmáticas. Las O-GlcNAcilaciones son modificaciones post-traduccionales en residuos serina/treonina que regulan las funciones de un gran número de proteínas. En esta tesis hemos identificado que el péptido ß-amiloide aumenta tanto la actividad de la OGT como las O-GlcNAcilaciones de las proteínas en microglía, siendo el eje Rac1/PYGM necesario para estas modificaciones. Además, hemos identificado que una de las proteínas O-GlcNAciladas en estas condiciones es la galectina-1. Cuando la galectina-1 es O-GlcNAcilada, hemos descrito que controla el splicing o procesamiento del pre-mRNA de genes como el de H-Ras. La galectina-1 O-GlcNAcilada también controla la migración y fagocitosis microglial. Por consiguiente, en esta tesis doctoral se ha identificado un eje de señalización formado por el péptido ß-amiloide/ integrina ß-1/ Rac1/ PYGM/ galectina-1-O-GlcNAc que controla el splicing, la migración y la fagocitosis en microglía.

La Enfermedad de Alzheimer (EA) cursa, entre otras cosas, con un hipometabolismo de la glucosa en el cerebro. Esta anomalía del metabolismo de la glucosa se manifiesta décadas antes de la aparición de síntomas y marcas histopatológicas características de la enfermedad. Llegar a descifrar el nexo entre el metabolismo de la glucosa en el cerebro con la muerte neuronal podría ser clave para entender la progresión de la neurodegeneración y especialmente la EA. A este respecto, cabe destacar la relación funcional entre los diferentes linajes celulares presentes en el cerebro y particularmente la relación entre astrocitos y neuronas. Los astrocitos son las células que abastecen de energía a las neuronas, además de transferir derivados de la glucosa proveniente del torrente circulatorio poseen el mayor almacén de glucógeno en el cerebro y cuya movilización también se traduce en transferencia de derivados de glucosa a al neurona. Los astrocitos en presencia de Aß1-42 oligomérico cambian su funcionalidad, traduciéndose éste en una afectación negativa para la biología de las neuronas del sistema nervioso central. Considerando el papel clave del péptido Aß1-42 en la fisiopatología de la EA, en general y en el metabolismo de la glucosa en particular, nosotros hemos investigado el papel del péptido Aß1-42 en el eje de señalización intracelular Rac1/PYGM/glucógeno en astrocitos y hemos observado que este eje de señalización gobierna la ruta de la biosintética de hexosaminas con objeto de mediar modificaciones postraduccionales por O-glicosilación de determinadas proteínas y estas O-glicosilaciones alteran la función de éstas como es el caso del receptor de LPA isoforma1.

PCNA (Proliferating Cellular Nuclear Antigen) es la abrazadera que es desliza sobre el ADN necesaria para la replicación del ADN y la respuesta al daño. PCNA interactúa con numerosas proteínas a través de una secuencia conservada y conocida como motivo PIP. Resultados del laboratorio identificaron PCNA como una de las 10 principales proteínas que interactúan con la enzima desubicuitinasa (DUB) USP29 y hemos descubierto que la expresión de USP29 disminuye la poli-ubicuitinación de PCNA en respuesta a un estrés genotóxico y que esta des-poli-ubicuitinación depende de la actividad catalítica de USP29. Los diferentes intentos realizados para purificar la proteína USP29 resultaron infructuosos. Usando péptidos sintéticos como modelo, hemos determinado que la interacción con PCNA no ocurre a través de ninguno de los motivos PIP identificados en la secuencia USP29. En cambio, los ensayos de co-inmunoprecipitación mostraron que el dominio PH (Pleckstrin Homology) del extremo N-terminal de USP29 interactúa con PCNA, aunque no tiene un motivo PIP. La purificación del dominio PH no tuvo éxito. Descubrimos que USP29 forma dímeros/oligómeros a través del dominio PH y dicha dimerización es necesaria para la actividad de USP29 como DUB. La ADN polimerasa ¿ es la encargada de replicar la cadena rezagada del ADN a través de su unión con PCNA. PCNA interactúa con todas las subunidades de Pol ¿, pero solo la interacción con p68 y p12 se ha caracterizado estructuralmente. En esta tesis, los análisis basados en RMN y calorimetría isotérmica de la interacción p125-PCNA han identificado que el fragmento C-terminal de la subunidad catalítica de la polimerasa humana ¿ (p125996-1009) se une PCNA a través de un motivo PIP no canónico, con una constante de disociación de 103 ± 14 ¿M at 37 °C.

La disfunción mitocondrial desempeña un papel clave en el inicio y desarrollo de las enfermedades hepáticas crónicas. La proteína J controlada por metilación (MCJ) es un inhibidor endógeno de la actividad mitocondrial, y previamente hemos podido demostrar niveles significativamente aumentados de MCJ en pacientes con hígado graso, daño hepático inducido por paracetamol y lesión hepática debido a la colestasis, lo que sugiere una posible asociación entre MCJ y la disfunción mitocondrial. La enfermedad hepática alcohólica causa más de 2 millones de fallecimientos en el mundo y es la segunda causa de trasplante hepático. Sin embargo, carece de un tratamiento específico. Por otro lado, las tasas actuales de trasplante hepático cubren menos del 10% de las necesidades globales, y entre las estrategias para aumentar el grupo de donantes, se ha propuesto el uso de hígado con criterio expandido, aquellos que provienen de hígados añosos o esteatóticos. Sin embargo, el uso de estos órganos aumenta el fallo hepático post trasplante, ya que su capacidad regenerativa está limitada y sufren una alta susceptibilidad hacia el daño por isquemia. En ambos modelos la disfunción mitocondrial es un indicador temprano del daño hepático y hemos podido comprobar la sobreexpresión de MCJ en estadios avanzados. De hecho, el silenciamiento hepático de MCJ (1) recupera la actividad mitocondrial, alivia la esteatosis y evita la inflamación y el estrés oxidativo en modelos preclínicos de enfermedad hepática alcohólica, y (2) acelera la regeneración hepática y reduce la lesión isquémica en ratones jóvenes, pero significativamente, también en ratones añosos y esteatóticos, promoviendo su uso para el trasplante hepático, reduciendo así la escasez existente de donantes. En resumen, este proyecto muestra la contribución de la disfunción mitocondrial, en especial de la proteína MCJ, en el desarrollo de la enfermedad hepática alcohólica y la regeneración limitada junto con mayor susceptibilidad isquémica que se observa en hígados con un metabolismo comprometido, con el objetivo de establecer dicha proteína como futura diana terapéutica para el tratamiento de enfermedades hepáticas crónicas.

El objetivo a largo plazo de nuestro grupo es estudiar a nivel molecular la estructura, la especificidad por sustrato y el mecanismo de acción de diferentes enzimas bacterianas involucradas en el reconocimiento o modificación de carbohidratos que sean relevantes en la interacción, tanto beneficiosa como patogénica, con el ser humano como hospedador. En este contexto, durante mi tesis, he trabajado en la comprensión a nivel estructural de la catálisis, así como del mecanismo de reconocimiento del sustrato de enzimas de bacterias tanto beneficiosas (Akkermansia muciniphila) como perjudiciales (Mycobacterium tuberculosis) para la salud del hospedador. Siguiendo este criterio, la tesis ha sido dividida en dos secciones; el estudio de la maquinaria enzimática que Akkermansia muciniphila, bacteria que forman parte de la microbiota intestinal, presenta para la digestión de los azúcares presentes en las mucinas por un lado, y el estudio de la biosíntesis de los glucolípidos (fosfatidil-myo-inositol mannósidos; PIMs, lipomannanos; LM y lipoarabinomannanos; LAM) presentes en la compleja envoltura celular de M. tuberculosis, por otro lado.

Wnt-11 es una proteína que se encuentra altamente expresada en el cáncer de próstata metastático, donde favorece la diferenciación neuroendocrina, la supervivencia y la migración celular activando señales a través de la familia de factores de transcripción AP-1/ATF, independientes de ß-catenina. Para caracterizar los efectos de la inhibición selectiva de Wnt-11, se generaron dos anticuerpos monoclonales anti-Wnt-11, E8 y F10, que tienen el mismo epítopo en Wnt-11. Los anticuerpos reconocen Wnt-11 en contexto celular, reducen la fosforilación del efector de Wnt DVL, reducen la proliferación en esferas de células de cáncer de próstata, inhiben la migración e invasión celular y la migración de células en hipoxia. Se llevó a cabo la conjugación de E8 y F10 a nanopartículas magnéticas (MNP) y se determinó que las nanoformulaciones anti-Wnt-11 inhiben la migración celular sin afectar a la viabilidad. Tanto E8 como la nanoformulación MNP-E8 reducen el crecimiento tumoral de células PC3 en el modelo in vivo de la membrana corioalantoidea de pollo, CAM. Se caracterizó un mutante de Wnt-11 con el epítopo de los anticuerpos delecionado, y se determinó que esta región tiene un papel relevante en la función y señalización de Wnt-11. La deleción del epítopo limita la migración celular inducida por Wnt-11, reduce la fosforilación de DVL, inhibe la transcripción dependiente de ATF2 y produce una disminución en la interacción de Wnt-11 con un correceptor de Wnt. En conjunto, los resultados resaltan el papel de Wnt-11 como una posible diana terapéutica y los anticuerpos anti-Wnt-11 y sus nanoformulaciones como potenciales agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer de próstata metastático.

Esta tesis doctoral se ha centrado en el empleo de diferentes herramientas químicas desarrolladas para el estudio de interacciones lípido-proteína y proteína-proteína en el contexto del Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (VIH-1). Por un lado, se ha utilizado una sonda bifuncional, un colesterol fotoactivable marcado radiactivamente, para estudiar la posible interacción entre el colesterol de la membrana celular y la proteína Gag del HIV-1 durante la morfogénesis del virus. Se ha visto que, usando esta metodología, no parece haber una interacción directa entre Gag y el colesterol, sin embargo, se postula la existencia de una interacción indirecta entre ambos vía la proteína gp41 de la envuelta del virus. Por otro lado, se ha desarrollado un palmitoilo clickable, se ha probado su eficacia y se ha puesto a punto un protocolo de extracción de proteínas palmitoiladas basado en esta sonda, la química click y la fuerte unión entre biotina y avidina. Este protocolo se ha utilizado para la extracción de proteínas palmitoiladas a partir de partículas virales no infectivas de HIV-1 con el fin de descubrir su palmitoiloma, es decir, el conjunto de proteínas palmitoiladas que conforman el virión ya sean de origen viral o celular. Como resultado, los análisis proteómicos han demostrado la obtención de un abundante número de proteínas exclusivas de los viriones tratados con el palmitoilo clickable y que previamente se encontraban descritas en la literatura como proteínas palmitoiladas.

El sistema Hsc70 humano controla funciones esenciales para la viabilidad celular, como la neutralización de conformaciones proteicas mal plegadas y la reactivación de agregados formados cuando la agregación es inevitable. La Hsc70 es el componente principal del sistema, pero requiere de dos proteínas accesorias: un miembro de la familia Hsp40 y un intercambiador de nucleótidos de la familia Hsp110. La familia Hsp40 es la más numerosa y diversa desde el punto de vista funcional y estructural, y sus miembros regulan la especificidad funcional de Hsc70. A pesar de su importancia, no existen estructuras de Hsp40s completas a alta resolución y se desconoce la función de muchas de ellas, sobre todo de las que pueden formar oligómeros. En esta Tesis se ha caracterizado la estructura y función de DnaJA2, una Hsp40 humana de clase A implicada en la homeostasis proteica, y cómo la fosforilación de residuos específicos regula su actividad y la colaboración con Hsc70. Demostramos que DnaJA2 se autoasocia formando estructuras ordenadas y tubulares que pueden interactuar productivamente con Hsc70. La alta eficiencia del sistema Hsc70 para replegar proteínas desplegadas unidas a DnaJA2 indica que el ensamblaje oligomérico podría servir como un andamio que facilita la unión simultánea de varias Hsc70 al sustrato para su remodelado eficiente. Por otro lado, demostramos que la fosforilación de residuos específicos localizados en diferentes dominios de DnaJA2 podría regular su estado oligomérico, actividad holdasa y colaboración con Hsc70. Esta regulación mediada por fosforilación podría servir como un interruptor para mejorar el equilibrio entre la protección de proteínas desplegadas y su replegamiento por el sistema Hsc70 en ciertas circunstancias, sin alterar las funciones esenciales en las que Hsc70 está implicada.

Eritasun Zeliakoa (EZ) genetikoki sentikorrak diren pertsonetan garatzen den gaixotasun autoimmune konplexua da. Glutenak erantzun immunea eragiten die eta gaur egun dagoen tratamendu bakarra bizi osorako glutenik gabeko dieta zorrotza jarraitzea da. EZri lotutako sentikortasun genetikoa HLA geneekin eta HLAtik kanpoko hainbat eremu genomikorekin asoziaturik dagoela jakina den arren, haien ekarpena gaixotasunean oraindik ez dago guztiz deskribatua. Horrek zaildu egiten du beharrezkoak diren dietaz besteko tratamendu berrien garapena. Lan honetan XPO1en 5'UTRan kokatutako EZri lotutako nukleotido bakarreko polimorfismoaren (SNP) inplikazio funtzionala deskribatzen dugu zeliakoen hesteko epitelioan ezaugarri den hantura-ingurunean. Arrisku aleloak m6A metilazio handiagoa eragiten du XPO1en 5'UTRan, XPO1 proteina kopuru handiagoak eta ur-beherako NF-kB bidezko hantura eraginez. Gainera, glutenaren esposizioak m6A metilazio orokorra areagotzen duela erakutsi dugu gizakietan, baita in vitro eta in vivo ereduetan ere. Hala, EZ gaixoetan aktibatzen den m6A-XPO1-NF-kB bide berri bat deskribatu dugu, hurbilketa terapeutiko berriak garatzea bultzatu dezakeena.

Uno de los mayores problemas en la cli¿nica a la hora de tratar el ca¿ncer de mama es el desarrollo de resistencia a las terapias endocrinas, debido a su alta frecuencia y mayor agresividad. Se ha demostrado que las ce¿lulas madre canceri¿genas (CSC del ingle¿s cancer stem cells) esta¿n involucradas en el inicio y progresio¿n tumoral, asi¿ como en el desarrollo de resistencia a diversas terapias. Un ana¿lisis computacional identifico¿ a la fosfatidilserina descarboxilasa (PISD), una enzima involucrada en el metabolismo de los fosfoli¿pidos, como un candidato involucrado en ambas resistencias. Se demuestra que la reduccio¿n de los niveles de expresio¿n de PISD afecta sobre todo a las células resistentes a tamoxifeno y a inhibidores de aromatasa en cuestión de proliferación y CSC, tanto in vitro como in vivo. El mecanismo por el que las células resistentes se ven más afectadas no está totalmente esclarecido, pero se propone una reactivación de la vía del receptor de estrógeno. Por otro lado, la generacio¿n de ce¿lulas que sobre expresan de manera estable PISD muestra que el aumento en la expresio¿n de PISD no es suficiente para alterar la proliferación celular en condiciones adherentes. Sin embargo, el aumento de los niveles de PISD revela una tendencia en el aumento de las poblaciones de CSC. En conclusio¿n, los datos sugieren que las ce¿lulas endocrinas resistentes dependen ma¿s de PISD para proliferar, para mantener las poblaciones de CSC y formar tumores, sin embargo, su sobre expresio¿n no es suficiente para impulsar el fenotipo de resistencia a tratamientos endocrinos.

-Biosensores fluorescentes codificados genéticamente -Cribado de compuestos a gran escala -Receptores acoplados a proteínas G -Ensayos celulares multicolores -Segundos mensajeros La primera fase del desarrollo de nuevos medicamentos comienzan con el cribado a gran escala de cientos de miles de moléculas. Normalmente este tipo de de cribados se realiza en plataformas de alta capacidad denominadas HTS (High-througput screening) o HCS (High-content screening). En esta tesis se ha desarrollado y caracterizado una familia de biosensores fluorescentes codificados genéticamente para medir los cambios de concentración intracelular de los segundos mensajeros Ca 2+, AMPc y DAG generados por la señalización de los receptores de membrana tipo GPCR. Posteriormente los biosensores se han implementado en ensayos celulares multiplex para su aplicación en el cribado de compuestos a gran escala en plataformas HTS y HCS.

Introducción El Glioblastoma es el tumor más frecuente y agresivo del sistema nervioso central con un pronóstico extremadamente sombrío; más de la mitad de los pacientes fallecen al año del diagnóstico, la mayoría antes de los dos años y menos del 5% alcanzan a sobrevivir 5 años tras el diagnóstico. A pesar del advenimiento de los grandes avances de la medicina en las últimas décadas, la supervivencia sigue siendo similar a las primeras series publicadas por P. Bailey y H. Cushing hace ya casi 100 años atrás (Bailey, Cushing 1926), probablemente debido a alto grado de heterogeneidad interindividual e intertumoral que presenta. Los avances científicos en la técnicas de investigación diagnósticas de las anomalías genéticas-moleculares sobre el genoma, transcriptoma y proteoma celular, han demostrado que la gliomagenesis implica múltiples errores genéticos en la replicación y reparación del ADN, en la segregación cromosómica, en numerosas cascadas de señalización y en múltiples vías celulares, moleculares, metabólicas e inmunológicas, por lo que la caracterización integral de estas alteraciones, en correlación con la clínica, el diagnóstico radiológico y el impacto de las medidas terapéuticas, podrían contribuir a una mejora en el abordaje de estos pacientes. Objetivo Caracterizar y correlacionar las principales alteraciones histopatológicas, genéticas, moleculares, clínicas, tumorales y analizar el impacto de las medidas terapéuticas empleadas en la calidad de vida, recaída y supervivencia; lo que podría determinar un pronóstico más certero de estos pacientes, para poder establecer una conducta terapéutica de una forma más individualizada. Materiales y métodos Se estudiaron 95 variables categorizadas en 6 categorías (clínica, radiológica, anatomopatológicas-moleculares, tratamiento quirúrgico, tratamiento complementario, recaída-supervivencia) en una serie de 372 pacientes con diagnóstico anatomopatológico de Glioblastoma multiforme, en un periodo de 15 años comprendido entre enero del 2004 y diciembre del 2019, en el Hospital Universitario de Donostia y se realizaron múltiples análisis estadísticos descriptivos, de asociación, de impacto y de supervivencia entre ellas. Resultados Los resultados de los análisis estadísticos demostraron asociaciones estadísticamente significativas entre las variables clínicas (sexo, edad diagnóstica, sintomatología de presentación, antecedentes médicos-quirúrgicos, índice de comorbilidad de Charlson e índice de supervivencia a los 10 años, antecedentes oncológicos familiares y grado familiar, antecedentes de radiación craneal, hábitos tóxicos, estado funcional diagnóstico (Karnofsky) y deterioro cognitivo diagnóstico), radiológicas (localización tumoral, hemisferio cerebral afecto, comportamiento tumoral Unifocal o multifocal, volumen tumoral, contacto/infiltración/invasión del sistema ventricular, de las áreas elocuentes, de los ganglios basales, del sistema límbico o del cuerpo calloso y los ratios de perfusión tumoral), anatomopatológicasmoleculares (mutación de FGAP, TERT, PML, BMI-1, PDGFR, PTEN, SOX2, SOX9, P16, P21, P27, ATRX, EGFR, EGFR-VIII, MGMT, IDH-1, IDH-2, P53 y el índice de proliferación Ki-67), del tratamiento quirúrgico (número de intervenciones quirúrgicas, grado de resección tumoral, demora quirúrgica, uso de fluoresceína sódica intraoperatoria, administración de BCNU tópica, tiempo de ingreso hospitalario, estado funcional y necesidad de corticoterapia postquirúrgica), del tratamiento complementario (administración de radioterapia, técnica empleada, dosis de fracción y del total de sesiones, duración y toxicidad de esta, administración de TMZ concomitante, administración de TMZ adyuvante, dosis y número de ciclos, duración de esta, estado funcional, necesidad de corticoterapia y estado cognitivo mediante MMSE post tratamiento complementario), de la recaída (tiempo de recaída, tipo de recaída, estado funcional, uso de corticoterapia basal, tratamiento de rescate empleado, estado funcional y necesidad de corticoterpia post tratamiento de rescate), prediciendo la recurrencia de la enfermedad y la supervivencia. Los resultados obtenidos permiten comprender mejor la situación actual del Glioblastoma contribuyendo así a un abordaje integral del mismo que permita un pronóstico más certero y un tratamiento personalizado más efectivo. Conclusión Hemos identificado una serie de variables clínicas, radiológicas, histopatológicas, genéticas, moleculares y terapéuticas fáciles de obtener y de aplicar en la practica clínica que permiten estimar el pronóstico de los pacientes con Glioblastoma. La caracterización integral, identificación y correlación de dichas variables implicadas en la evolución clínica y desenlace de estos pacientes y el análisis de impacto clínico de las medidas terapéuticas empleadas pueden explicar en parte las diferencias interindividuales en la calidad de vida y supervivencia de estos pacientes, contribuyendo a determinar un pronóstico más certero, para poder establecer así, diferentes abordajes terapéuticos de una forma más individualizada.

E2F-dependent transcriptional network ensures the timely entry of cells into S-phase through the regulation of a vast array of genes involved in DNA replication and cell cycle progression. In this Thesis, we aimed to decipher the role of E2F1 and E2F2 in the metabolism of nucleotides and the implications that E2F activity might have in tumor progression and resistance against chemotherapy. We show that in non-tumoral cells, targeted depletion of E2f1 and E2f2 in mice leads to a downregulation of genes encoding Tk1 and Dck (rate-limiting enzymes of the salvage pathway for nucleotide production), as well as to the activation of DNA damage. Importantly, this phenotype could be rescued with an exogenous supply of nucleotides. In tumor cells, enhanced E2F activity is thought to supply the nucleotides required for their exacerbated DNA replication. We found that the expression of E2F1/E2F2 correlates with malignancy in human prostate cancer and is necessary to maintain steady-state levels of TK1, DCK and TYMS and to prevent genomic instability during S phase. Silencing of E2F1/E2F2 in metastatic prostate cancer (mPCa) cells leads to DNA damage and compromises cellular viability, whereas addition of nucleosides, or the products of TK1 and DCK enzymatic activities improves cellular viability of E2F1/E2F2 knockdown cells, suggesting that the E2F/TK1-DCK-TYMS axis is crucial to preserve DNA integrity in mPCa cells. Furthermore, we show that mPCa cells are resistant to the apoptosis induced by the nucleoside analog 5-fluorouracil (5-FU) through the induction of TK1, DCK and TYMS expression. Remarkably, combined silencing of E2F1/E2F2 prevents 5-FU-induced upregulation of TK1, DCK and TYMS and reverses resistance of mPCa cells to 5-FU, whereas adding nucleosides or the products of TK1 and DCK activities increases the viability of E2F1/E2F2 knockdown cells treated with 5-FU. Interestingly, treatment of mPCa cells with the E2F pathway inhibitor Palbociclib in combination with 5-FU dramatically reduced their viability. Collectively, our findings emphasize the relevance of the E2F pathway for providing nucleotide intermediates necessary to preserve DNA integrity in normal and cancer cells, and for driving resistance to 5-FU of mPCa cells. Inhibition of E2F activity could be a promising strategy to fully prevent nucleotide biosynthesis and sensitize tumor cells to cell death after treatment with 5-FU.

La LGMDR1 es la forma más común de las distrofias musculares de cinturas, y está causada por mutaciones en el gen CAPN3. Este gen codifica la proteína calpaína 3, una proteasa no lisosomal que se expresa principalmente en el músculo esquelético. La enfermedad, que actualmente no tiene cura ni tratamiento disponible, se caracteriza clínicamente por una debilidad muscular progresiva que afecta tanto a las cinturas pélvica y escapular como a los músculos proximales de las extremidades. Actualmente, la investigación en LGMDR1 requiere por un lado de mejores modelos animales y celulares para su investigación, ya que los existentes presentan limitaciones por la ausencia de un proceso distrófico claro, y por otro lado de una mayor comprensión del impacto de la ausencia de calpaína 3 en el músculo. Con esto en mente, en esta tesis se fijaron como objetivos principales 1) Desarrollar un modelo in vitro basado en líneas isogénicas de iPSCs KO para calpaína 3 mediante el uso de CRISPR/Cas9. 2) Evaluar las consecuencias de la ausencia de calpaína 3 en procesos musculares mediante el uso del modelo generado y el modelo en ratón existente (C3KO). 3) Generar un nuevo modelo in vivo KO de calpaína 3 en la especie porcina mediante el uso de CRISPR/Cas9. Tras el trabajo realizado, se obtuvo el modelo in vitro que se planteó y se caracterizó, el cual diferenciaba adecuadamente a células musculares. Los estudios con el modelo generado y el ratón C3KO concluyeron que la miogénesis está afectada en ausencia de calpaína 3, se estudió la respuesta al daño muscular agudo y se identificaron proteínas y funciones desreguladas. En cuanto al modelo porcino, tras optimizar el protocolo para la obtención de embriones KO de calpaína 3, se realizaron varias transferencias embrionarias, pero ninguna de las gestaciones dieron como resultado un lechón KO por lo que no se llegó a conseguir el modelo.

Chronic inflammatory diseases are the most significant cause of death in the world. Indeed, according to the World Health Organization (WHO), 3 out of 5 people die due to chronic inflammatory diseases such as stroke, chronic respiratory diseases, heart disorders, cancer, obesity or diabetes. It has been demonstrated that sphingolipid metabolism is altered in this type of disorders. Therefore, understanding the molecular mechanisms by which bioactive sphingolipids participate in the establishment or progression of those diseases may be useful for developing novel therapeutic strategies to control them. In the first chapter of this thesis, we demonstrate that the bioactive sphingolipid ceramide 1-phosphate (C1P) induces survival, proliferation and migration of preadipocytes through mechanisms that implicate the PI3K/Akt, MEK/ERK1-2 and JAK/STAT3 signaling pathways. These biological actions suggest a possible role of this phosphosphingolipid in fat accumulation and dysfunction of adipose tissue, which might lead to metabolic diseases, most notably, obesity. In the second chapter we show that exogenous C1P inhibits alveolar macrophage migration, an action that seems to be caused by dephosphorylation of important proteins that are involved in the regulation of cell migration, such as, PKB/Akt, ERK1-2, PAK1 and Paxillin. In addition, the latter study provides evidence that granular nanosized silica (SiO2)-conditioned medium enhances alveolar macrophage migration through activation of PI3K/Akt signaling cascade and that C1P inhibits this action by blocking PKB/Akt phosphorylation. Taken together, the results of this thesis support the notion that C1P may have anti-inflammatory properties in lung cells.

El Síndrome de Angelman es una enfermedad rara que se caracteriza por la ausencia de la E3 ligasa de ubicuitina UBE3A en las neuronas. Numerosos datos sugieren una relación entre CAMKII y UBE3A. En esta tesis se emplea el etiquetado por proximidad con BioID2 y TurboID, tanto en cultivos celulares como en Drosophila melanogaster, con el fin de identificar posibles interactores. Mediante esta estrategia hemos sido capaces de identificar la E3 ligasa de ubicuitina ITCH como la responsable de monoubicuitinar a CAMKIIa y a la deubiquitinasa MYSM1 como un mediador indirecto de la ubicuitinación de CAMKIIa. Además, cuando CaMKIIa se encuentra más ubicuitinada, su fosforilación en la T286 y, por tanto, activación se ve reducida. Los experimentos en mosca permitieron identificar varias proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas y la proteína Nbea, también identificada como posible sustrato de UBE3A, involucrada en el espectro autista. Por otro lado, nuestro grupo recientemente ha identificado la proteína Neurocondrina (NCDN) como un sustrato de UBE3A en el cerebro de ratón. NCDN regula de forma negativa la fosforilación de T286 de CaMKII, reduciendo así su actividad. Observamos que las cadenas a través de la lisina 48 son las que se forman en NCDN por UBE3A y la envían a su degradación. Finalmente, realizamos un estudio sobre cuáles eran las lisinas de NCDN que tendían a ser ubicuitinadas por UBE3A. Los resultados, aunque prometedores, no identificaban de manera significativa ninguna lisina dentro de la secuencia de NCDN.

Garunean UBE3A ubikitina ligasaren gabeziak neurogarapenaren nahaste bakana den Angelman sindromea (AS) eragiten du, kortex prefrontalaren funtzioaren alterazioekin eta narriadura kognitiboarekin lotua dagoena Tesi honetan UBE3Aren substratu diren hainbat proteina identifikatu eta balioztatu dira. Ikusi da UBE3Aak proteasomaren eta sinapsiaren funtzionamenduan eragina izan dezakeela bertako proteinen ubikitinazioa erregulatuz. Gainera UBE3Aren substratu den DDI2 anezka-proteinak kortex prefrontalaren eskualde prelimbikoan kitzikagarritasuna erregulatu dezakeela frogatu da. Halaber, DUB inhibitzaileak probatzeko eskualde prelimbikoko kitzikagarritasuna azter daitekeela eta DUBek eta DUBen inhibitzaileek kitzikagarritasun neuronalaren testuinguruan duten zeregina ebaluatzeko balizko paradigma dela baieztatu da. Ildo horretatik, DUB inhibitzaile den WP1130 drogak Angelman sindromearekin loturiko kitzikagarritasun aldaketak egiteko gai dela ikusi da. Tesi honetan, hortaz, UBE3Aren ubikitinazioaren inguruko ezagutza zabaltzea lortu da, bai UBE3A substratu berriak identifikatuz zein substratu eta interaktore horiek funtzio neuronalean izan dezaketen eragina neurtuz.

El objetivo de mi tesis se centra en el desarrollo de partículas recombinantes que imitan las pre-ßHDL naturales, para su utilización como medio de transporte de microRNAs. Estas partículas serían utilizadas para tratar en el futuro lesiones ateroscleróticas, las cuales son la mayor causa de las enfermedades cardiovasculares. En la primera etapa de mi tesis profundicé en la caracterización de las nanopartículas de diferentes composiciones para escoger la composición más efectiva a la hora de captar colesterol de células que participan en la formación de la placa de ateroma. En la segunda etapa, se escogieron las nanopartículas más eficientes en cuanto a unión de microRNA y se utilizaron para transportar el antagomir-33ª a células espumosas para promover la upregulación del transportador de colesterol ABCA1. Esta etapa se realizó en un modelo in vitro de ateroma de 3 líneas celular para imitar el compartimento aterosclerótico. En este fase de la tesis se observó que la administración sucesiva de 2 composiciones de rHDLs (una para transportar el antagomiR-33a, y la otra para captar el colesterol) aumenta de manera significativa el eflujo de colesterol de las células espumosas.

Potencial de los microRNAs en el diagnóstico, clasificación y pronóstico del linfoma difuso de células grandes B El Linfoma difuso de células grandes B (LDCGB) es la neoplasia maligna linfoide más común en adultos y representa del 30 al 40% de los linfomas no Hodgkin (LNH). El LDCGB se presenta con antecedentes variables en términos de morfología, genética y comportamiento biológico, lo que da lugar a respuestas heterogéneos entre los pacientes. Aunque se han desarrollado nuevas herramientas para la clasificación y el manejo de los pacientes, el 40% de ellos todavía presentan enfermedad refractaria o recaída. Además, varios factores relacionados con la patogénesis de esta enfermedad siguen sin estar claros y es necesaria la identificación de nuevos biomarcadores. En este contexto, investigaciones recientes apuntan a los microRNAs como biomarcadores útiles en el cáncer, así como como participantes importantes en el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, en lo que respecta al LDCGB, los estudios realizados hasta el momento presentan resultados contradictorios. Por tanto, en este trabajo, los principales objetivos fueron determinar una firma microRNAs con utilidad como biomarcadores para el diagnóstico, clasificación, pronóstico y respuesta al tratamiento de DLBCL, así como descifrar el mecanismo de acción de los microRNAs desregulados en el origen de la enfermedad. Para lograr estos objetivos, primero determinamos si los microRNAs ya propuestos en la literatura eran biomarcadores fiables en DLBCL en nuestra población. De este modo, identificamos una firma de cuatro microRNAs desregulados de forma consistente en DLBCL en el momento del diagnóstico. Sin embargo, el número limitado de microRNAs analizados en la bibliografía y la inconsistencia en los resultados no nos permitió identificar firmas de clasificación, respuesta al tratamiento o pronóstico. A continuación, analizamos todos los microRNAs existentes en DLBCL mediante secuenciación de RNAs pequeños en nuestra cohorte de pacientes y dicha aproximación sí que nos permitió definir nuevas firmas para diagnóstico, clasificación, respuesta al tratamiento y pronóstico. Finalmente, utilizando un análisis de red de interacción microRNA-RNA mensajero, identificamos posibles mecanismos de acción por los cuales los microRNAs desregulados podrían estar involucrados en la patogénesis de LDCGB. En resumen, nuestro estudio destaca que los microRNAs podrían jugar un papel importante como biomarcadores en el diagnóstico, clasificación, respuesta al tratamiento y pronóstico en LDCGB, así como en la patogenia de la enfermedad. Además, la tecnología de secuenciación NGS es de gran valor, ya que permite detectar asociaciones incluso con microRNAs poco estudiados.

El envejecimiento es un proceso sistémico, multifactorial y degenerativo caracterizado por el declive y la pérdida de capacidades físicas y mentales. La esperanza media de vida ha aumentado considerablemente en el último siglo, incrementando así el número de personas mayores en la población y, por tanto, las limitaciones funcionales y las enfermedades relacionadas con la edad. En este sentido, la fragilidad representa un nuevo síndrome geriátrico que se caracteriza por una pérdida de la capacidad funcional y una disminución de la capacidad de respuesta al estrés fisiológico, lo que resulta en una mayor vulnerabilidad del individuo y en resultados negativos para la salud. Se trata de una afección dinámica que se está convirtiendo en un importante problema de salud que es necesario detectar e intervenir. Se sabe relativamente poco sobre la fisiopatología de este síndrome y los mecanismos moleculares subyacentes a la fragilidad siguen siendo poco conocidos. Con el fin de abordar esta cuestión, se analizó el perfil transcriptómico de un conjunto de individuos robustos y frágiles residentes en el País Vasco, y se encontraron 35 genes expresados diferencialmente que se asociaron con el estado de fragilidad. Éstos incluían genes asociados a inflamación, respuesta inmune o miRNAs, procesos previamente relacionados con la fragilidad. Entre ellos, 7 candidatos fueron validados en cohortes independientes y también mostraron un patrón de expresión similar en mioblastos y fibroblastos primarios humanos mantenidos en cultivo. Su expresión fue parcialmente restaurada tras diferentes programas de intervención en individuos frágiles. Análisis adicionales revelaron la expresión de un conjunto mínimo de 3 genes (aumento de EGR1 y disminución de DDX11L1 y miR454) fuertemente asociados con el estado de fragilidad y las características clínicas vinculadas a la fragilidad como la multimorbilidad y la polifarmacia. Además, descubrimos su papel en el envejecimiento celular e identificamos su actividad como mediadores de vías asociadas a la senescencia, convirtiéndose en potenciales actores en la fisiopatología de este síndrome geriátrico. En conjunto, nuestros resultados revelan un vínculo entre fragilidad y senescencia. El envejecimiento cerebral consiste en una pérdida progresiva de las capacidades funcionales que se asocia a un deterioro cognitivo progresivo y puede conducir a enfermedades neurodegenerativas. Aunque se han utilizado diferentes enfoques para identificar biomarcadores y vías moleculares subyacentes al envejecimiento cerebral, se mantienen en gran medida desconocidos. Los centenarios, muestran una longevidad extrema que se acompaña de una mejor función cognitiva, menos comorbilidades y una mayor calidad de vida y, por lo tanto, se han propuesto como modelo de envejecimiento saludable. En nuestro estudio, realizamos análisis transcriptómicos en muestras de hipocampo humano de individuos de diferentes edades, incluyendo individuos jóvenes, ancianos y centenarios, con el fin de abordar los mecanismos moleculares subyacentes al envejecimiento cerebral. Identificamos un patrón de expresión génica diferencial en muestras cerebrales de centenarios en comparación con los otros dos grupos. En particular, varios miembros de la familia de genes de las metalotioneínas (MTs) se expresaron en gran medida en el hipocampo de los centenarios. Estos hallazgos se validaron en dos cohortes adicionales e independientes. En particular, las MTs fueron expresadas principalmente por los astrocitos y estudios funcionales in vitro describieron el papel de las MTs en su viabilidad y actividad. De hecho, el silenciamiento de MT1 o MT3 en astrocitos humanos primarios provocó una disminución de la proliferación, un aumento de la apoptosis y la senescencia, junto con un incremento de la expresión de genes inflamatorios. En general, estos resultados muestran que el hipocampo de los centenarios presenta altos niveles de MTs, que se expresan principalmente en los astrocitos convirtiéndose en un mecanismo defensivo que podría proporcionar neuroprotección en el cerebro durante el envejecimiento. Otros análisis adicionales, revelaron un subconjunto de 6 genes cuya expresión se correlacionaba con el envejecimiento cronológico en el hipocampo humano. Entre ellos, el descenso de RAD23B mostró las mayores diferencias a nivel estadístico tanto en humanos como en ratones. La validación en cohortes adicionales confirmó la disminución de los niveles de RAD23B con la edad, también a nivel proteico, que se agravaban en condiciones patológicas, ya que sus niveles eran más bajos o totalmente ausentes en pacientes con enfermedad de Alzheimer. Además, experimentos de silenciamiento en cultivos celulares in vitro demostraron que estaba implicado en la viabilidad y actividad de los astrocitos, lo que indica que es un biomarcador putativo y regulador del envejecimiento celular en el cerebro.

El Magnesio (Mg2+) es un micronutriente esencial en la dieta humana debido a su papel en diversos procesos celulares y enzimáticos. En esta tesis hemos identificado cómo un desequilibrio en el contenido de Mg2+ en el hígado tiene un papel clave en el desarrollo de las enfermedades hepáticas. Con este propósito, hemos estudiado la expresión de los diferentes transportadores de Mg2+ encargados de controlar los niveles intracelulares de Mg2+ en la célula. Hemos identificado que el transportador de Mg2+ Ciclina M4 (CNNM4) actúa como un extrusor de Mg2+ en el hígado. Bajo condiciones de hepatotoxicidad, CNNM4 se transloca de la membrana plasmática al RE. Esta localización anómala de CNNM4 en el RE puede ser una de las principales causas que inducen estrés de retículo y desregulación de la homeóstasis de calcio (Ca2+) en el daño hepático causado por la sobredosis de paracetamol y la exposición prolongada al alcohol. La sobreexpresión de CNNM4 reduce los niveles de Mg2+ mitocondriales, afectando a la movilidad del Ca2+ entre el RE y la mitocondria y dando lugar a una disfunción mitocondrial. Por lo tanto, proponemos el silenciamiento especifico de Cnnm4 como terapia para el tratamiento de DILI causado por paracetamol así como la enfermedad hepática alcohólica (EHA). (1) GalNAc siCnnm4 revierte los niveles de Mg2+ a niveles basales, reduciendo la disfunción mitocondrial y el estrés de RE. (2) GalNAc siCnnm4 es un tratamiento eficaz para el daño hepático por sobredosis de paracetamol en una ventana terapéutica en la que NAC no es efectiva. (4) En EHA, GalNAc siCnnm4 induce la actividad de la metiltransferasa PIMT, cuya función es la reparación de proteínas dañas a causa del alcohol. El silenciamiento de PIMT inhibe el efecto terapéutico del GalNAc siCnnm4. (5) Hemos propuesto un modelo tridimensional de la estructura de CNNM4 combinando los resultados derivados de la biología estructural así como de Alphafold. (6) Hemos realizado una caracterización biofísica y estructural del interactoma conocido de los CNNMs.

El objetivo de este trabajo es el diseño y desarrollo de nuevas etiquetas mediadas por proteínas para estudiar sistemas biológicamente relevantes. Específicamente, el proyecto se centra en el diseño de andamios moleculares basados en proteínas que promuevan la estabilización de nanoclusters metálicos (NCs) luminiscentes y puntos cuánticos (QDs) como nuevas etiquetas duales para microscopía de fluorescencia y electrónica. Este enfoque aprovecha tanto las propiedades luminiscentes como la densidad electrónica de los nanomateriales estabilizados con proteínas para su aplicación como etiqueta dual para técnicas de imagen correlativa. Finalmente, las nuevas etiquetas duales desarrolladas en este trabajo se utilizan para reproducir el sistema de trasporte retrógrado de proteínas in vitro como prueba de concepto para futuros estúdios biológicos.

Carbohydrates are one of the most variable and complex molecules of biological systems. They are usually located at the cell membrane, mainly as glycoconjugates, glycoproteins or glycolipids and play an important role in the specific molecular recognitions. Since structure and function are intrinsically correlated, the three-dimensional shape, dynamics and presentation of these molecules is essential for the recognition processes to take place. In this work, we have employed a combination of X-Ray crystallography and Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR) techniques, for obtaining atomic-scale information on the interactions of glycans and glycomimetics, using either intact glycoproteins (the receptor binding domain of the spike glycoprotein of SARS CoV2) or small molecules, with different receptors related to human diseases, with special emphasis on galectins and siglecs (immune response). The presented methodology allows disentangling the fine details of the vital glycan epitopes, providing key information for the development of novel therapeutics.

Tha ¿-glucans, polysaccharides made of repetitive units of glucose, play a role as energy storage, as with intracellular glycogen, or as structural components, as with the capsular ¿-glucans surrounding the pathogenic Mycobacterium tuberculosis. Bacterial glycogen provides survival advantage during starvation periods whereas the mycobacterial capsule is critical in mediating host-pathogen interactions. The tetrameric enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) catalyzes and controls: I) the initial step of glycogen biosynthesis and II) the synthesis of ADP-Glucose as precursor for the capsular ¿-glucan biosynthesis. In this work we disclose the cryoEM structures of the paradigmatic AGPase from Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis. The former, solved in the presence of the main positive and negative allosteric regulators, reveal distinct physiological conformational states that have different availability for ATP. Biochemical and microbiological evidence that support the latter show that single point-mutants in the catalytic and putative allosteric sites were unable to produce neither the product of reaction nor glycogen and the capsular ¿-glucans. Los ¿-glucanos, polisacáridos formados por unidades repetitivas de glucosa, desempeñan un papel como almacenamiento de energía, como ocurre con el glucógeno intracelular, o como componentes estructurales, como ocurre con los ¿-glucanos capsulares que rodean la bacteria patógena M. tuberculosis (Mtb). El glucógeno bacteriano proporciona una ventaja para la supervivencia durante los periodos de inanición, mientras que la cápsula de la micobacteria es fundamental en las interacciones huésped-patógeno. La enzima ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) cataliza y controla: I) el paso inicial de la biosíntesis de glucógeno y II) la síntesis de ADP-glucosa, precursor de la biosíntesis del ¿-glucano capsular. En este trabajo presentamos las estructuras crioEM de la AGPasa de E. coli y M. tuberculosis. Las primeras, resueltas en presencia de los principales reguladores alostéricos, revelan estados conformacionales fisiológicos y distintos que presentan diferente accesibilidad por ATP. Las pruebas bioquímicas y microbiológicas que respaldan la estructura de la MtbAGPasa muestran que algunos mutantes del sitio catalítico y del posible sitio alostérico no son capaces de producir ni el producto de la reacción, ni el glucógeno, ni los ¿-glucanos capsulares.

Prostate cancer (PCa) is the most frequent neoplasm and the second worldwide. Multiple key drivers of pathogenesis have been well studied, among which the oncogene c-MYC and the tumour suppressor PTEN show remarkable relevance. c-MYC gene is located on the chromosome 8q24, a region that is frequently amplified in PCa, encompassing tens of genes. However, the relevance of other genes that are co-amplified with c-MYC has not been sufficiently addressed. In this study, we aimed at identifying relevant PCa genes within the c-MYC-containing amplicon. To this end, we employed a comprehensive panel of in silico, in vitro and in vivo strategies and identified Tribbles homolog 1 (TRIB1), a member of a family of pseudokinases, as a candidate gene that contributes to PCa pathogenesis under the influence of c-MYC amplicon. Analysis of publicly available genomic and transcriptomic data revealed that TRIB1 is among the most highly expressed genes within c-MYC amplicon in PCa. Molecular analysis of the regulation of TRIB1 revealed that beyond its upregulation through amplification, this gene is also under tight transcriptional control by the PTEN-c-MYC axis, thus explaining its robust overexpression in PCa. Further characterization of the cellular phenotype resulting from TRIB1 perturbation demonstrated that alterations in this gene are inconsequential for PCa cells in vitro in cell autonomous assays. We evaluated the contribution of the pseudokinase to PCa pathogenesis in vivo through the generation of a tissue-specific conditional transgenic mouse model. Strikingly, elevation of Trib1 levels in combination with heterozygous deletion of Pten elicited PCa, together with changes in the tumour microenvironment. Overall, our work describes a novel double- layered control of TRIB1 by c-MYC and provides formal demonstration of the contribution of this pseudokinase to PCa initiation.

Las modificaciones postraduccionales (MPTs) son un conjunto de modificaciones covalentes y reversibles que sufren las proteínas tras su biosíntesis, considerándose un mecanismo relevante en la diversificación funcional, coordinación de vías de señalización y modulación del proteoma. Recientemente, la atención se ha centrado en el estudio de las MPT similares a la ubiquitina en el desarrollo de diversas patologías para comprender mejor su etiología y proponer nuevas terapias basades en su regulación. Sobre esta base, el presente trabajo se centra en el estudio de NEDD8 (célula precursora neuronal expresada, regulada negativamente durante el desarrollo 8), una proteína de 8 kD que se conjuga covalentemente en los residuos de lisina de sus proteínas diana en un proceso denominado nedilación. Los sustratos más conocidos son las culinas, un grupo de enzimas ligasa de ubiquitina, aunque también se ha descrito substratos diferentes a las culinas modulando su estabilidad, localización y función. Este trabajo muestra que la nedilación está incrementada e involucrada en el desarrollo de varias patologías a través de la desregulación del proteoma, particularmente en enfermedades hepáticas como la del hígado graso no alcohólico (EHGNA), el cáncer infantil hepatoblastoma (HB), así como en la hiperactivación del sistema inmunológico como se ve en pacientes graves con infección por coronavirus (COVID-19). Por lo tanto, se propone el tratamiento farmacológico del MLN4924 dirigido a la inhibición de la nedilacion mediante la modulación de NAE1 (enzima 1 activadora de NEDD8), como terapia efectiva para restaurar la homeostasis del proteoma alterado en la enfermedad. El tratamiento con MLN4924 mejora la EHGNA al aumentar la oxidación de ácidos grasos vía la inactivación de la ruta de mTOR disminuyendo la acumulación de lípidos hepáticos; reduce el fenotipo maligno de las células de HB, induciendo la muerte de las células tumorales; y, por último, activa la respuesta inmunosupresora en pacientes graves de COVID-19.

Las células ¿natural killer¿ (NK) son un componente clave del sistema inmunitario innato y una de sus funciones es reconocer y eliminar células malignas. El trasplante autólogo de precursores hematopoyéticos (TASPE) es un tratamiento establecido en todo el mundo para muchos tumores hematológicos, incluyendo el mieloma múltiple (MM). Se ha descrito que la reconstitución temprana de las células NK tras el TASPE tiene un papel muy importante en el pronóstico de los pacientes con MM. El objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar los cambios en las subpoblaciones de células NK durante su reconstitución tras un TASPE en pacientes diagnosticados con MM. En esta tesis doctoral, en primer lugar, observamos que la expresión del receptor NKp80 en la superficie de las células NK no se veía alterada en diferentes condiciones y que, además, era más específico que el marcador CD16 tradicionalmente usado para identificar las células NK CD56neg. Además, mediante el uso de la citometría de flujo y el análisis del trascriptoma mediante secuenciación de ARN (ARN-seq), demostramos que las células NK experimentan un cambio tanto fenotípico como a nivel de perfil de expresión génica tras el TASPE. De este modo, los experimentos de ARN-seq demostraron que las células NK adquieren un fenotipo similar al de las células NK deciduales. Por último, descubrimos que la frecuencia de células NK con el fenotipo NKG2A-CD57+ se asocia al pronóstico de pacientes con MM sometidos a TASPE.

El cáncer de próstata (CaP) es el segundo cáncer con mayor índice de mortalidad en hombres en la actualidad. Estos fallecimientos se deben a la falta de un buen pronóstico que permita anticipar los casos que van a recidivar. Estudios previos han establecido firmas basadas en genes metabólicos que permiten diferenciar los pacientes con alto riesgo de recurrencia de los indolentes. Por ello, como primer objetivo de esta tesis, se mejoraron y validaron en una cohorte externa de pacientes estas firmas metabólicas. El análisis de los genes que constituyen dichas firmas descubrió una serie de alteraciones metabólicas no asociadas con ningún proceso oncológico hasta ahora y con funciones metabólicas muy diversas. Entre ellas, destacó la represión de ASPA observada en aquellos pacientes que presentaban recurrencia. De todas las alteraciones metabólicas, ASPA, era la que mayor poder pronóstico presentaba. Así, el análisis a nivel molecular de la contribución de ASPA al CaP nos permitió descubrir que es un gen que se reprime en los fibroblastos por acción de TGFß, cuando estos se convierten en fibroblastos asociados al tumor. Esta represión de ASPA genera la acumulación de su sustrato el NAA que provoca la repolarización de macrófagos hacia un fenotipo protumoral. Estos macrófagos protumorales contribuyen a la progresión tumoral y justifican que niveles bajos de ASPA se asocien a peor pronóstico de los pacientes de CaP.

La naturaleza dinámica y reversible de las modificaciones post-traduccionales por parte de los miembros de la familia de la ubiquitina plantea importantes desafíos durante su investigación. En esta Tesis presentamos dos nuevas estrategias, SUMO-ID y E3-ID, basadas en proteómica de proximidad y marcaje por biotina, que permiten investigar a fondo los fundamentos biológicos de los códigos de ubiquitina y SUMO. Por un lado, SUMO-ID combina la biotinilación de proximidad mediada por la enzima TurboID con la complementación de fragmentos proteicos para identificar interactores de proteínas de interés dependientes de SUMO. Hemos desarrollado un punto de escisión optimizado de TurboID y, fusionando un fragmento a SUMO y el fragmento complementario a PML, hemos podido identificar numerosos interactores de PML dependientes de SUMO. Hemos demostrado que dichos interactores representan un subconjunto del proteoma de los cuerpos nucleares de PML maduros y que participan en procesos nucleares esenciales tales como transcripción, reparación del ADN, respuesta al estrés y SUMOilación, estando altamente enriquecidos en motivos de interacción con SUMO. Asimismo, SUMO-ID nos ha permitido identificar nuevos interactores de SALL1 SUMOilado, cuyo rol es todavía desconocido. Finalmente, utilizando TP53 como sustrato, hemos identificado qué proteínas interactúan preferencialmente vía SUMO1, SUMO2 o ubiquitina, lo que demuestra la gran especificidad de SUMO-ID y que se puede aplicar para estudiar otras interacciones UbL-dependientes. Por otro lado, E3-ID se basa en la enzima BirA que biotinila específicamente la secuencia AviTag. Expresando en células la fusión de AviTag con ubiquitina junto a la fusión de BirA con una E3 ligasa de interés, E3-ID permite identificar sustratos específicos de E3 ligasas de ubiquitina. Mediante un AviTag de baja afinidad, el sistema E3-ID identifica específicamente los substratos de la E3 ligasa tipo RING RNF4, lo que ha permitido caracterizar sus funciones fundamentales en la respuesta al daño de DNA y en la regulación de los cuerpos nucleares de PML. También se han identificado substratos de la ubiquitina E3 ligasa MIB1, describiendo su participación en la endocitosis, la autofagia y la proteostasis centrosomal. Finalmente, aplicando E3-ID a las ligasas del tipo HECT NEDD4 y NEDD4L, e identificando nuevos substratos de NEDD4L se confirma su participación en la endocitosis de EGFR. En resumen, hemos desarrollado dos nuevas estrategias que contribuirán en gran medida a la investigación del código de las proteínas de la familia de ubiquitina y SUMO.

La medicina de precisión debe considerarse como un enfoque innovador de la medicina tradicional ya que se centra en un tratamiento más personalizado de las patologías de los pacientes en función de sus características individuales. El estudio del mecanismo molecular asociado a una enfermedad y la identificación de los biomarcadores implicados en el desarrollo y la progresión de dicha patología se consideran factores esenciales para obtener un mejor diagnóstico y una optimización de la terapia. La metabolómica proporciona una imagen completa del organismo y permite observar los cambios metabólicos específicos que caracterizan a un individuo debido a su condición de salud o a factores externos. En concreto, la metabolómica por resonancia magnética nuclear (RMN) es especialmente adecuada para este tipo de análisis, ya que las mediciones se realizan de forma rápida y sencilla, es una técnica que ofrece la posibilidad de identificar y cuantificar numerosos metabolitos, las muestras no necesitan derivatización y por tanto se acelera la obtención de resultados. En este trabajo decidimos aplicar las ventajas que ofrece esta técnica al estudio de dos enfermedades no relacionadas entre sí: el síndrome metabólico y a la reciente pandemia mundial causada por el virus SARS-CoV-2.

Los factores de transcripción E2F son cruciales en la regulación de genes involucrados en la progresión del ciclo celular, la replicación del ADN, la reparación de daño al ADN o la duplicación de los orgánulos. En este trabajo se realizó un análisis bioinformático con el fin de encontrar nuevos genes diana de los E2F que pudieran estar asociados al ciclo celular y al cáncer. En dicho análisis se identificó a TEDC2 (Tubulin Epsilon and Delta Complex 2), proteína centriolar poco caracterizada, como potencial diana de los E2F. Observamos que las muestras tumorales con una elevación de los niveles de TEDC2 se correlacionaban con un peor pronóstico. El gen TEDC2 se co-expresa y presenta codependencia con otros genes que participan en la duplicación centriolar y en mitosis. Demostramos que la expresión de TEDC2 está regulada durante el ciclo celular con un máximo en la entrada de fase S, momento en el que E2F1 se une al promotor de TEDC2, activando su transcripción. Respecto a su localización subcelular, TEDC2 se localiza en el material pericentriolar y en el anillo del midbody, para lo que requiere dos dominios de localización. TEDC2 interacciona con proteínas del ciclo del centrosoma, destacando a CEP295 y a las tres proteínas con las que forma el complejo TED: TEDC1 y las tubulinas ¿ y ¿. Predicciones de la estructura del complejo TED sugieren que TEDC1 ejerce de puente entre el heterodímero de las tubulinas ¿ /¿ y TEDC2. Por último, experimentos de silenciamiento mostraron que TEDC2 es indispensable para la correcta duplicación de los centriolos y la función del centrosoma.

La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo estudiar como nuevas variantes genéticas de diversos genes inducen el desarrollo de hipercolesterolemia familiar, así como descifrar los mecanismos moleculares detrás de los efectos pleiotropicos de las estatinas, consideradas como el tratamiento de referencia para los pacientes de dicha enfermedad. Está claramente establecido como mutaciones en los genes LDLR, APOB y PCSK9 son responsables del desarrollo de la hipercolesterolemia familiar, y a su vez, como el tratamiento con estatinas que reciben estos pacientes se asocia con un incremento del 13% en el riesgo de desarrollar Diabetes Mellitus de tipo 2 (DMT2). Por ello, con la intención de presentar los resultados obtenidos durante este estudio de la manera más clara posible, estos se han distribuido en dos capítulos. El capítulo 1 hace referencia al estudia llevado a cabo sobre nuevas variantes encontradas en los genes LDLR, APOB y PCSK9, asociados como hemos dicho anteriormente al desarrollo de la hipercolesterolemia familiar. Esta parte está compuesta por una Introducción General sobre la enfermedad, su diagnostico y tratamiento, unos Objetivos Generales, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión de los resultados obtenidos en este capítulo. Además, se ha incluido una sección con los resultados obtenidos durante la ¿estancia virtual¿, un trabajo llevado a cabo en colaboración con la Dra. Giuliana Fortunato y Ma Donata di Taranto. Por otro lado, con la intención de elucidar los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de DMT2 en pacientes hipercolesterolémicos tratados con estatinas, y debido a la complejidad y extensión del estudio, los resultados experimentales obtenidos acerca del mismo se han incluido en el Capítulo 2. Este segundo capítulo, sin ser dependiente del primero, surge como consecuencia natural del estudio de los efectos secundarios asociados al tratamiento que reciben los pacientes con Hipercolesterolemia Familiar. Este capítulo consta de una introducción general acerca de la DMT2 y el efecto diabetogénico de las estatinas, que proporciona el contexto apropiado para entender los procesos implicados en dicha relación, además de unos Objetivos Generales, Materiales y Métodos, Resultados y una Discusión de estos últimos. En resumen, los dos capítulos que conforman esta Tesis Doctoral sirven para explicar los mecanismos moleculares implicados tanto en el desarrollo de la Hipercolesterolemia Familiar, como en la modulación epigenética asociada al tratamiento de los pacientes de la enfermedad.

Estudios de asociación de genoma completo han detectado polimorfismos asociados con el riesgo a padecer diabetes de tipo 1 (DM1) en ARN largos no codificantes (lncRNAs). Sin embargo, todavía se desconocen los mecanismos moleculares por los que la mayoría de estos lncRNAs contribuyen al desarrollo de la DM1. Los estudios recogidos en esta tesis doctoral confirman la presencia de lncRNAs implicados en el desarrollo de DM1. Así mismo, se ha realizado la caracterización funcional de 2 de estos lncRNAs; llamados Lnc13 y ARGI. Gracias a estos estudios se demuestra la importancia de estas moléculas no sólo en el funcionamiento celular (en esta tesis centrada en el estudio de las células ß pancreáticas), sino también en el desarrollo de diversas enfermedades como son la diabetes.

Aging is associated with a series of phenotypic changes at the cellular level, including changes in gene expression. In recent years, aged tissues have been reported to present an increase in transcriptional noise or cell-to-cell variability. In order to test this, a new method (Scallop) for the quantification of transcriptional noise from single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data has been developed, which is based on cluster membership. In addition, a compilation of methods used in the literature has been implemented in the Python toolkit Decibel. A systematic analysis of published scRNA-seq datasets of murine and human aged tissues using Scallop and Decibel revealed that increased transcriptional noise is not a universal hallmark of aging. A deeper analysis of four scRNA-seq datasets of the murine aging lung showed that, even though there are no consistent cell type-specific changes in transcriptional noise levels, the aging lung is characterized by a reproducible enrichment in immune cell types, which was also seen in two human datasets. Interestingly, an exploratory analysis of gene expression datasets of murine and human aging revealed a previously undetected hallmark of aging: aged tissues present a generalized length-dependent transcriptional decay. This length-dependent underexpression (LDU) was also observed in premature aging models caused by exposure to environmental genotoxicity (UV radiation and tobacco smoke) and in two progeroid syndromes caused by defects in the transcription-coupled nucleotide excision repair pathway (TC-NER): Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. These results suggest that accumulation of genotoxicity in long genes could lead to reduced RNA polymerase II procesivity.

El factor de transcripción SOX9 es un regulador de células madre que ejerce un papel muy relevante en el desarrollo embrionario y también en la etapa adulta, en el mantenimiento de la homeostasis de diferentes tejidos, incluyendo el sistema digestivo. Además, SOX9 es también un regulador de las células madre del cáncer y, en consecuencia, ejerce un papel relevante en múltiples tipos de neoplasias malignas, incluyendo cánceres gastrointestinales como el cáncer gástrico (CG), el cáncer colorrectal o el adenocarcinoma pancreático (PDAC), y también en tumores cerebrales como el glioblastoma (GB). En esta tesis doctoral, demostramos que SOX9 promueve la progresión tumoral regulando procesos clave en las células diferenciadas de CG, PDAC y GB, y que ejerce esta actividad a través del eje oncogénico BMI1-p21CIP. Además, partiendo de los genes más correlacionados con SOX9 en muestras de pacientes con CG, identificamos una firma de cuatro genes (DIAPH3, KIF11, TPX2 y ECT2) asociada a un mal pronóstico en CG y múltiples tipos de cáncer. También identificamos funcionalmente la actividad pro-tumoral de DIAPH3 y KIF11 en GC y PDAC, y demostramos la acción antitumoral de agentes inhibidores de los mismos. Por último, ampliamos nuestro estudio al contexto de la homeostasis gástrica y la respuesta a la infección por Helicobacter pylori, el factor de riesgo más importante en CG, hallando que SOX9, KIF11 y DIAPH3 se expresan principalmente en las células progenitoras de las glándulas gástricas, y que se produce una expansión de las células Sox9-positivas en respuesta a H. pylori.

The study of tumor metabolism has uncovered a new therapeutic window for the treatment of some cancer types. In such paradigm, cell signaling and metabolic reprogramming can act in tandem for the benefit of the cancer cell. Prostate cancer (PCa), the second most common cancer diagnosed in men worldwide, is a clear example of this convergence. Previous studies conducted in our lab have shown how polyamine (PA) biosynthesis is elevated in PCa with profound implications in the progression of the disease. However, PA deprivation therapy has failed in patients in the last years and currently, in spite of the conclusive data about the contribution of PAs to cancer biology, their molecular effectors remain obscure. In this thesis, we describe a mechanism orchestrated by activating transcription factor 4 (ATF4) signaling through which PCa cells could acquire survival properties and resistance to therapies targeting polyamine metabolism. In addition, we provide solid evidence about the regulatory function of PAs in the process of mRNA splicing through changes occurring at posttranslational level. Overall, our results expand the current knowledge about the role of PAs in both physiology and disease.

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) es una condición del neurodesarrollo que presenta diversos síntomas, entre los que destacan los déficits en comunicación y comportamiento social y la presencia de movimientos repetitivos/restrictivos. A día de hoy no existe tratamiento y múltiples estudios en animales y humanos se han centrado en diferentes sistemas neuronales para explicar su patofisiología. En concreto, en esta tesis se han estudiado el sistema cortical de excitación e inhibición y el circuito dopaminérgico. Para ello se ha utilizado un modelo murino de autismo, que tiene el gen Cntnap2 eliminado y refleja los mismos síntomas que se han detectado en humanos. En el primer estudio, relacionado con la parte del sistema excitación/inhibición, no se encontró ninguna alteración relevante que pudiera clarificar el papel del gen Cntnap2 en las alteraciones observadas en este modelo. Por otro lado, se estudió el sistema dopaminérgico a nivel estructural y funcional y los resultados revelaron alteraciones funcionales en el modelo de autismo, que se ven reflejadas en una menor activación de las neuronas dopaminérgicas del Área Tegmental Ventral (ATV) y una liberación anómala de dopamina en el Núcleo accumbens (NAc) durante la interacción social. Además, se pudo revertir estos déficits sociales con activación quimiogenética de las neuronas dopaminérgicas del ATV, lo que confirmaba que éstas son las responsables de dichos déficits sociales.

La macroautofagia es un proceso que ocurre en los organismos eucariotas, se caracteriza por la formación del autofagosoma, una estructura de doble membrana encargada de rodear los componentes celulares que se degradan cuando se fusiona con el lisosoma. En humanos, las seis proteínas LC3/GABARAP participan en varios pasos de la formación del proceso. Para llevar a cabo su función, estas proteínas establecen diferentes interacciones con lípidos. El objetivo principal de esta tesis fue estudiar el efecto de la ceramida en algunas interacciones entre estas proteínas y membranas modelo. Se demostró que la ceramida es capaz de aumentar su unión a membranas que contienen cardiolipina, lo significa que la ceramida podría tener un papel en la unión de estas proteínas solubles a mitocondrias durante la mitofagia. Se describió que este efecto tendría lugar en las zonas enriquecidas en cardiolipina, donde una baja cantidad de ceramida sería suficiente para aumentar su unión. Por último, la ceramida aumentó notablemente la capacidad fusogénica de los homólogos GABARAP y GABARAPL1, una vez anclados a la membrana, por lo que la ceramida podría estar implicada en la labor de expandir el autofagosoma.

Hu antigen R (HuR, por sus siglas en inglés) es una proteína de unión a ARN que posee el control postranscripcional de múltiples transcritos que codifican proteínas involucradas en procesos tanto fisiológicos como patológicos. La implicación de HuR en el carcinoma hepatocelular ha sido continuo foco de estudio. Recientemente, la modulación de las modificaciones postraduccionales de proteínas está suscitando interés como estrategia terapéutica en la oncología. Curiosamente, las modificaciones postraduccionales constituyen el mecanismo principal de regulación de HuR. Asimismo, la sumoilación se encuentra inducida en cáncer, pudiendo ser un nuevo mecanismo postraduccional que controlara la función de HuR en el carcinoma hepatocelular. Además de su relevancia en la diferenciación de varios tejidos, la función fisiológica de HuR es poco conocida. El hígado es el centro de numereros procesos fisiológicos, incluida la regulación del metabolismo de la glucosa, que podría estar controlada por HuR. Así, el objetivo de este trabajo consiste en generar nuevo conocimiento sobre la función de HuR como regulador postranscripcional en respuesta a la sumoilación durante el carcinoma hepatocelular, y a cambios en la homeostasis de la glucosa bajo circunstancias fisiológicas y de diabetes tipo 2.

Among the hundreds of nuclear-encoded components of mitochondria that have been linked to human disease, mutations in the ATAD3 gene cluster have emerged as one of the most frequent in recent years. The ATAD3 locus encodes three highly homologous mitochondrial transmembrane proteins that are members of the AAA+ protein family. ATAD3 has been implicated in mitochondrial DNA and cholesterol metabolism, as well as mitochondrial morphology and ultrastructure. In this thesis, several new ATAD3 mutants have been characterized and have been studied in cultured human cells and in a Drosophila model. These investigations have identified elevated free and membrane-embedded cholesterol as core features of pathological ATAD3 variants. Thus, this is a recurring cellular phenotype characteristic of mutant ATAD3, and as such, it represents a valuable new diagnostic tool, in combination with ATAD3 protein separation and immunodetection. Moreover, a model of the molecular mechanism of the disease has been proposed in which the high level of cholesterol results in cholesterol aggregates in membranes provoking an extraordinary expansion of lysosomes to digest the aberrant membranes. Multiple strategies aimed at modulating cholesterol and lipid metabolism increased cholesterol levels and none decreased it, which might exacerbate rather than mitigate the ATAD3 cellular phenotypes. However, sphingosine supplementation distinguished the ATAD3 mutants from control cells, which identifies an important future avenue for developing therapies.

The skin is a complex vital organ composed of several layers. The middle layer, the dermis, is mainly composed of fibroblasts that produce the extracellular matrix (ECM) providing structural support. Recent research using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) has revealed previously unrecognized heterogeneity among dermal fibroblasts, challenging the traditional understanding of their organization. The work conducted in this thesis thoroughly analyses multiple human and mouse dermal scRNAseq datasets , uncovering a functional heterogeneity of fibroblasts never described. Fibroblast heterogeneity can be divided in major axes and minor populations, and more than 15 populations are described in each species. These populations were associated with specific functions, such as ECM production, immune response, involvement in skin adnexa such as hair follicles, or specialised supportive functions related to vasculature and nerve fibres. Additionally, while there are similarities between mouse and human fibroblasts, differences in their arrangement suggest species-specific variations in overall fibroblast function. This atlas serves as a valuable resource for researchers investigating skin function and diseases, enabling unbiased annotation of their datasets and facilitating the identification of compositional differences and novel fibroblast types associated with various skin conditions.

El Siglo XX se han logrado importantes avances en la investigación de esta novedosa área, con el objetivo de trasladar a la clínica nuevas terapias basadas en RNAi. El ARN pequeño de interferencia (siRNA, por sus siglas en inglés) es el principio activo de estos nuevos fármacos y está cuidadosamente diseñado para unirse al mRNA del gen diana. En el citoplasma celular, una serie de proteínas interactúan tras la unión del siRNA con el mRNA, provocando la degradación del transcrito y evitando así la producción de la proteína asociada al mRNA a silenciar. De esta forma, una enfermedad provocada por una mutación genética podría verse claramente mitigada sin necesidad de modificar la secuencia de ADN. No obstante, el potencial de esta nueva terapia se ha visto limitado debido a la naturaleza del siRNA, que dificulta su administración in vivo de forma sistémica. El ARN es un material tremendamente sensible a enzimas nucleasas, ubicadas en todo el organismo, las cuales degradan cualquier ARN exógeno. El siRNA (con una longitud entre 20 y 25 pares de bases) posee un tamaño reducido que se filtra fácilmente en los glomérulos haciendo que su tiempo de circulación sea muy corto. Otra de las barreras que presenta la administración de siRNA es la dificultad para dirigirlo específicamente al tejido diana y su correspondiente internalización celular. El siRNA no es lo suficientemente pequeño para entrar por difusión simple y su carga negativa provoca que sea repelido por componentes de la membrana celular, también de carga negativa. Además, la entrada del siRNA en el citoplasma se realiza mediante la formación de un endosoma, desde el cual tendrá que liberarse para no terminar siendo degradado en el lisosoma. Todas estas barreras hacen imposible la administración por vía intravenosa del siRNA libre y es necesaria su unión a vectores de distinta naturaleza. La nanomedicina y el diseño de nanomateriales para el transporte de fármacos ofrece vías para la introducción sistémica de material genético foráneo. Los nanovectores proporcionan protección al siRNA frente a las nucleasas, evitan su eliminación por la orina y permiten su acumulación en un tejido especifico. Son capaces de traspasar la membrana plasmática y posibiltan al siRNA escapar del endosoma. Sin la ayuda de estos vectores la aplicación del siRNA no sería posible, salvo en ciertos tejidos y órganos que permiten la captación del siRNA de forma libre tras una administración local. Sin embargo, los nanomateriales tienen que cumplir una serie de características para poder ser utilizados como vectores. Principalmente deben tener la capacidad de interaccionar con el material genético y tener la habilidad de encapsularlo. Se han desarrollado distintos tipos de nanomateriales que pueden actuar como vectores, la mayoría de ellos comparten la característica común de que presentan una carga eléctrica positiva que les permite interaccionar con la carga negativa de los fosfatos en el material genético. Entre las distintas estrategias para el desarrollo de nanovectores encontramos, entre otras, el uso de lípidos y polímeros catiónicos, nanopartículas inorgánicas recubiertas de material catiónico, exosomas y moléculas covalentemente unidas al oligonucleótido. La mayoría de las terapias más avanzadas en ensayos clínicos utilizan vectores basados en lípidos que forman liposomas o nanopartículas lipídicas (LNPs) y siRNAs unidos a un trímero de N-acetilgalactosamina (GalNac). Ambos vectores tienen como diana proteínas de la membrana de los hepatocitos, por lo que su administración se ve limitada al hígado. En 2018 fue aprobado ONPATTRO, el primer medicamento basado en el siRNA para el tratamiento de la amiloidosis hereditaria por transtirretina, que utiliza como vector LNPs. A este fármaco le siguieron otros (GIVLAARI and OXLUMO) usando también el hígado como diana y utilizando conjugados GalNac como vector. La mayoría de los ensayos clínicos realizados se han enfocado en enfermedades hepáticas principalmente por limitaciones de los vectores. Encontrar nuevos transportadores funcionales para explotar el potencial del siRNA es fundamental para el desarrollo de nuevas terapias más allá del hígado. Por ello continúan los esfuerzos en mejorar y desarrollar nuevos vectores. En esta tarea cobran un papel relevante los materiales poliméricos que presentan una gran versatilidad para ser modificados y producidos a gran escala, además de poseer una gran capacidad de encapsulación del material genético. A lo largo del desarrollo de esta tesis se han investigado dos estrategias orientadas al diseño de un nuevo vector para siRNA. Una de ellas está basada en la funcionalización catiónica del dextrano, un polisacárido de origen natural y la otra basada en la modificación con grupos hidrofóbicos de la polialilamina, un polímero sintético que contiene una amina primaria por unidad repetitiva. En el Capítulo 3 se recoge el trabajo realizado con el polímero dextrano, que se utilizó para la formación de nanopartículas de cadena única (del inglés, single-chain polymeric nanoparticles SCPN). El empleo de SCPNs como vectores se consideró como una estrategia prometedora debido al pequeño tamaño de partículas obtenidas y por los buenos resultados previos alcanzados en el transporte de antibióticos con estas nanopartículas. Para poder formar las SCPNs, los anillos de glucosa del dextrano fueron previamente modificados con grupos metacrilato, los cuales se conjugaron posteriormente con una molécula tiolada (3,6-dioxa-1,8-octano-ditiol, DODT) mediante la adición de Michael. El DODT presenta grupos tiol en ambos extremos que reaccionan con los grupos alqueno de una sola cadena de polímero, induciendo su colapso en una nanopartícula. Se introdujo un exceso de grupos metacrilato para la posterior modificación de la SCPN con grupos catiónicos, reaccionando nuevamente los grupos metacrilato restantes con la cisteamina, una molécula que presenta un grupo tiol y un grupo amino, a través de la adición de Michael. Así, la nanopartícula adquirió una carga positiva y pasó a denominarse SCPN-NH2. La modificación del dextrano con estos nuevos grupos fue caracterizada por resonancia magnética nuclear confirmando el éxito de la reacción. La misma estrategia de sustitución con cisteamina se aplicó al dextrano sin entrecruzar para obtener un sistema de control, que se denominó DXT-NH2 y de esta forma poder estudiar el efecto del entrecruzamiento en las propiedades de transfección. Se obtuvo un grado de sustitución de cisteamina del 21% en SCPN-NH2 mientras que con DXT-NH2 se obtuvo un 42%. Las aminas protonadas permiten el encapsulamiento del material genético debido a las interacciones electrostáticas con grupos aniónicos del siRNA y a la vez favorecen el escape endosomal debido al efecto tampón que producen durante la acidificación del endosoma. El tamaño de las partículas SCPN-NH2 se analizó por dispersión dinámica de la luz, obteniendo tamaños de 15 nm muy similares a las SCPN sin modificar. El análisis del potencial Z confirmó la carga positiva del SCPN aminado. Se conoce como poliplejo a la interacción entre un polímero y material genético. Esta interacción puede variar en función de la cantidad de polímero frente a la cantidad de material genético existente, es lo que se conoce como ratio N/P. El ratio N/P representa los moles de aminas protonables (N) presentes en el polímero dividido entre los moles de grupo fosfato (P) presentes en el material genético. En el caso de la presente tesis se utilizó como material genético siRNA y se formaron poliplejos con los polímeros de dextrano obtenidos. Se estudió dicha interacción mediante la técnica de retraso en gel (del inglés, gel retardation assay) a diferentes ratios N/P, en el que se confirmó la interacción con siRNA de las SCPN-NH2 y del polímero DXT-NH2. Además, se observó que a mayores ratios N/P, mayor es la encapsulación conseguida. Por otro lado, se estudió la viabilidad de la línea celular de pulmón A549 en presencia de estos dos materiales y ninguno de los ellos resultó ser citotóxico hasta concentraciones de 50 ¿g/mL. La internalización del material genético en las células fue evaluada por medio de microscopia confocal de fluorescencia tras marcar los vectores con el fluoróforo Rhodamina B y por otro lado, utilizando un siRNA marcado con carboxifluoresceina. Las imágenes de microscopía confocal se tomaron 24 horas después de la administración de los compuestos en las células A549. Los resultados obtenidos muestran la colocalización de DXT-NH2 y de siRNA en el interior celular. Sin embargo, las células tratadas con SCPN-NH2, presentan tan solo las nanoparticulas en el interior, pero no el siRNA. Posteriormente se realizó el ensayo de eficacia del siRNA, transfectando con los vectores SCPN-NH2 y DXT-NH2. Para este estudio se utilizó la línea celular A549-GFP, que expresa de forma estable la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés). Las células fueron transfectadas con los vectores de dextrano acomplejando un siRNA anti-GFP, diseñado para bloquear el mRNA de la proteína GFP. La eficacia del siRNA se evaluó 96 horas después de la transfección, midiendo la fluorescencia media de las células mediante citometría de flujo. Ninguno de los vectores mostró una reducción de la producción de proteína, mientras que el control positivo Lipofectamina RNAimax (vector comercial basado en lípidos) redujo la expresión de GFP hasta un 80%. Se decidió entonces no continuar con el uso de las nanopartículas de cadena única como vectores de siRNA debido a su incapacidad de llevar el fármaco al interior celular tras el ensayo de internalización y a la baja eficacia de transfección obtenida. Sin embargo, continuaron los esfuerzos para la modificación de la cadena de dextrano debido a los resultados positivos obtenidos en el ensayo de internalización y con el objetivo de mejorar la eficacia de silenciamiento. El dextrano se modificó con diferentes moléculas aminadas con la idea de proporcionar una mejora en la liberación del siRNA de la cavidad endolisosomal. Se estudiaron las siguientes moléculas aminadas que fueron seleccionadas de acuerdo al número de aminas primarias, secundarias o terciarias presentes en la molécula y a sus pKas, con el objetivo de mejorar la capacidad tampón del polímero en el interior del endosoma: espermina, 1-(3-aminopropil)imidazol, Tris (2-aminoetill)amina y 3,3'-(piperazina-1,4-diil)bis(propan-1-amina). Para la funcionalización del dextrano se utilizó el reactivo de Traut como mediador entre el alqueno del grupo metacrilato y el grupo amino. De acuerdo con la literatura, también se tuvo en cuenta el peso molecular del dextrano como posible causa de una baja liberación del siRNA del endosoma, ya que pesos moleculares más altos provocan interacciones más fuertes con los oligonucleótidos, impidiendo de esta forma una buena liberación. Para ello, se funcionalizaron con cisteamina dos dextranos de peso molecular 6KDa y 20 KDa. Todas estas nuevas modificaciones en los polímeros se caracterizaron mediante resonancia magnética nuclear y se formularon con siRNA anti-GFP. Después, los poliplejos obtenidos fueron evaluados como posibles vectores mediante el ensayo de reducción de GFP. Este ensayo permite de manera rápida, sencilla y cuantitativa discriminar nuevos materiales por su eficacia de silenciamiento. Los resultados obtenidos por citometría de flujo muestran una mejora respecto a las sustituciones con cisteamina, siendo las sustituciones con espermina, Tris (2-aminoetill) amina y 3,3'-(piperazina-1,4-diil)bis(propan-1-amina) los mejores vectores. Sin embargo, ninguno de los polímeros superó una reducción del 50% de proteína, ni se acercaba a los valores del 20% de expresión obtenidos con el control positivo Lipofectamina RNAimax. Por ello en el Capítulo 4 se desarrolló otra estrategia que consistió en la modificación de un polímero sintético de alta densidad amínica, en lugar de intentar introducir grupos amino en una cadena polimérica. La polialilamina es un polímero cuya unidad repetitiva presenta una amina primaria, la cual despierta el interés como vector de material genético. Sin embargo, es sabido que una alta densidad amínica puede derivar en citotoxicidad, es por ello que se buscó modificar la polialilamina con ácido oleico para neutralizar parcialmente su carga, buscando un equilibrio entre eficacia y toxicidad. El ácido oleico se seleccionó debido a la alta eficacia de transfección demostrada en vectores lipídicos. Se estudió el efecto del grado de sustitución unido covalentemente a la polialilamina en su capacidad como vector para el transporte y liberación de siRNA. Se realizaron 5 sustituciones de ácido oleico a equivalentes molares 1:0,01; 1:0,02; 1:0,05; 1:0,1 y 1:0,2 -NH2: -COOH, las cuales se nombraron PAH.OA.1, PAH.OA.2, PAH.OA.5, PAH.OA.10 y PAH.OA.20, respectivamente. El ácido oleico se unió a la amina del monómero de PAH por medio de la formación de un enlace amida gracias a la activación del ácido carboxílico mediante carbodiimida e hidroxisuccinimida en una mezcla de disoluciones de dimetilsulfóxido (DMSO) y agua. Los nuevos polímeros fueron caracterizados mediante diferentes técnicas analíticas: Por cromatografía de capa fina se reveló la ausencia de ácido oleico libre en la muestra tras la purificación por diálisis. Por medio de espectroscopia de infrarrojo se demostró la presencia de ácido oleico presente en el polímero mediante unión covalente con el mismo. La determinación del grado de sustitución fue la tarea más compleja de llevar a cabo debido a la poca solubilidad de la polialilamina sustituida con ácido oleico. Se probaron diferentes solventes para disolver la poliamina substituida, de los cuales el agua resultó ser el más eficaz. Sin embargo, la insolubilidad del polímero no permitió una cuantificación exacta del grado de sustitución mediante resonancia magnética nuclear, pero si estimaciones que resultaron ser 1%, 2%, 6%, 14% y >20% para los polímeros PAH.OA.1, PAH.OA.2, PAH.OA.5, PAH.OA.10 y PAH.OA.20. También se emplearon otras técnicas para determinar el grado de sustitución como análisis elemental y análisis por termogravimetría, pero ambas resultaron ser tan solo estimaciones. La baja solubilidad de la poliamina modificada con oleico se debe a la formación de nanopartículas en agua por medio de autoensamblaje de las cadenas poliméricas, a través de interacciones hidrofóbicas entre las cadenas de oleico. El tamaño de las partículas se determinó por dispersión dinámica de la luz y por microscopia electrónica de transmisión. Se obtuvieron partículas de 10 nm que se agregaban en estructuras más grandes alcanzando tamaños entre los 100 y 300 nm dependiendo de la cantidad de ácido oleico unido. Las partículas formadas presentan una carga superficial positiva, alcanzando valores de Potencial Z de +40 mV aproximadamente en todas las sustituciones. Se estudió la interacción de siRNA con estas partículas poliméricas, preparando los complejos con distintos ratios N/P 2,5; 5; 10 y 15. Los poliplejos resultantes se caracterizaron por tamaño, carga superficial y eficacia de encapsulación. Se observó que los poliplejos formados por polímeros de mayor cantidad de oleico (PAH.OA.5, PAH.OA.10 y PAH.OA.20) presentan tamaños similares a las partículas formadas solo por polímero, pero los complejos con siRNA presentan una polidispersidad menor. Por otro lado, los polímeros menos sustituidos (PAH.OA.1 y PAH.OA.2) sí que vieron reducido su tamaño. La carga superficial se redujo a +30 mV, debido a la compensación de cargas de las aminas por los fosfatos del siRNA. La eficacia de encapsulación se cuantificó con Quant-IT Ribogreen obteniendo encapsulaciones por encima del 90% en todos las sustituciones y ratios N/P. La evaluación de la poliamina sustituida con ácido oleico como vector de siRNA se detalla en el Capítulo 5 donde se llevaron a cabo distintos ensayos de los complejos polímero/siRNA. En primer lugar, se evaluó la viabilidad y el daño de la membrana de las células A549 tras la exposición a los poliplejos formados con las poliaminas substituidas. Se pudo observar que los polímeros con mayor cantidad de acido oleico resultaron ser menos citotóxicos que los menos sustituidos. Sin embargo, altas cantidades de polímero en ratios N/P 15 resultan citotóxicas en todas las sustituciones. El ratio idóneo resultó ser N/P 5 donde la viabilidad celular se mantiene por encima de un 95%. La internalización de los poliplejos se evaluó por microscopia confocal y citometría de flujo. Para estos experimentos se modificaron covalentemente todos los polímeros con el fluoróforo Atto633 y se utilizó siRNA-6-FAM, marcado con carboxifluoresceina. Por microscopia confocal se pudo observar la colocalización del polímero y del siRNA en el interior celular para todos los complejos a un N/P 5. La citometría de flujo reveló que de 10.000 células observadas, el 70% presentaron fluorescencia del siRNA en todos las sustituciones de polialilamina con ácido oleico, demostrando que el grado de sustitución no influye particularmente en mejorar la internalización celular. La eficacia de administración de los polímeros se midió por citometría de flujo, utilizando células que expresan GFP y tratándolas con siRNA anti-GFP. En este experimento ya mencionado en el Capítulo 3, las células A549-GFP se expusieron a una transfección de 24 horas con los complejos formados con las distintas sustituciones de polialilamina. A las 96 horas de la transfección se midió la fluorescencia media de las células por citometría de flujo y a diferencia de los experimentos de internalización, se pudo observar que el porcentaje de ácido oleico influye en la liberación de siRNA en el interior celular. Los poliplejos con sustituciones mayores de oleico, PAH.OA.5 y PAH.OA.10, se obtuvieron mejores eficacias de transfección que para los poliplejos con menor grado de sustitución, PAH, PAH.OA.1 y PAH.OA.2. Sin embargo, con los poliplejos formados con PAH.OA.20 no se obtuvo ningún silenciamiento. El sistema más eficiente se obtuvo con PAH.OA.10 con una reducción de proteína de hasta un 70%, niveles muy similares al 80% obtenido con el control positivo Lipofectamina RNAimax. El punto más destacable de este estudio es que el ácido oleico mejora la eficacia de silenciamiento de la polialilamina, sin embargo, ésta no viene dada por una mayor capacidad de internalización celular, sino por una liberación del endosoma más efectiva. Se llevó a cabo un estudio más detallado de la liberación por parte del siRNA de la cavidad endolisosomal, mediante la colocalización del lisosoma con el siRNA hasta 48 horas de exposición. Las imágenes de microscopia confocal revelan que parte del siRNA consigue liberarse del endosoma, sin embargo hay que puntualizar que una gran cantidad del siRNA también colocaliza con el lisosoma. Aun así, esa pequeña parte de siRNA libre es capaz de inducir el silenciamiento. Dados estos resultados prometedores, se decidió estudiar la eficacia de estos vectores con un siRNA terapéutico utilizado en el tratamiento de cáncer de pulmón mediante el silenciamiento de la CD47. La CD47 es una proteína de transmembrana que se expresa en la mayoría de las células del organismo, con una especial sobreexpresión en tumores como el de cáncer de pulmón de células no pequeñas. La proteína CD47 tiene un papel en la modulación del sistema inmune, ya que es reconocida por los macrófagos a través del receptor SIRP¿, situado en la membrana del mismo. La CD47 actúa como una señal de ¿no me comas¿ y evita que las células donde está expresada esta proteína sean fagocitadas por los macrófagos. Por otra parte, ante la ausencia de la CD47, esta unión no puede llevarse a cabo y se inicia el proceso de fagocitosis. Una estrategia terapéutica interesante consiste en reducir la expresión de la proteína CD47 por medio del silenciamiento génico e inducir la fagocitosis de células tumorales. Se llevaron a cabo varios ensayos para evaluar la reducción de la expresión del gen CD47 en células A549 a nivel de transcrito y a nivel de proteína siguiendo la transfección con siRNA anti-CD47 utilizando los vectores de polialilamina modificada con ácido oleico. El contenido de ARN mensajero de CD47 se midió por PCR cuantitativa, observándose una reducción en la expresión de CD47 hasta el 70% con el vector PAH.OA.10, coincidiendo con los porcentajes de transfección medidos por citometría de flujo para el silenciamiento de GFP. El mismo vector con un siRNA negativo no indujo ningún cambio en la expresión, descartando cualquier posible efecto del polímero en los resultados de transfección. Se midió el nivel de proteína en las células con tres técnicas de biología molecular: Western Blot, Inmunofluorescencia y citometría de flujo, demostrando el buen funcionamiento del polímero PAH.OA.10 como vector y anticipando su aplicación futura en el desarrollo de terapias contra el cáncer de pulmón, y a otras nuevas dianas posibles.

La enfermedad hepática crónica hace referencia a un amplio espectro de patologías hepáticas lenta progresión, pero potencialmente mortales. A pesar de los avances en diagnóstico y tratamiento, el estilo de vida sedentario, la adherencia a dietas poco saludables, el alcohol y el abuso de fármacos como paracetamol continúan exponiendo a las personas al desarrollo de enfermedades, lo que enfatiza la necesidad de desarrollar nuevas estrategias para abordar estos nuevos riesgos emergentes. La investigación de este trabajo se ha centrado en los desequilibrios metabólicos hepáticos que derivan del abuso de alcohol y toxicidad por paracetamol, identificando la enzima Glicina N-metiltransferasa (GNMT) como un principal afectado en el desarrollo de la enfermedad hepática crónica. Por otro lado, cada vez es mayor la evidencia que respalda el potencial regulador de los pequeños micro-ARN no codificantes en la enfermedad hepática. Estas moléculas tienen la capacidad de alterar la expresión de proteínas nivel post-transcripcional cuando se unen a sus ARNm diana, en base a estudios previos que demuestran la desregulación del micro-ARN miR-873-5p está implicado en la progresión de enfermedad hepática, este trabajo ha demostrado el potencial terapéutico de su inhibición en diferentes contextos de toxicidad hepática. El objetivo de esta investigación es explorar el potencial de biomarcadores no invasivos y comprender el papel de miR-873-5p en la regulación de GNMT y el desarrollo de enfermedades hepáticas inducidas por toxicidad derivada de alcohol y paracetamol. Estos hallazgos resaltan la importancia de GNMT en la enfermedad hepática crónica y señalan la necesidad de investigaciones adicionales para mejorar el diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades hepáticas.

Hepatitis C virus (HCV) is the second viral agent, after Hepatitis B Virus (HBV), that causes the major number of chronic hepatic infections worldwide. HCV infection comprises several steps since the attachment to the membrane receptors to the delivery of the viral genetic material and replication inside the cells. Tetraspanin CD81 is a key entry factor for HCV as it accompanies the virus during membrane attachment and internalization through clathrin-mediated endocytosis. The HCV-CD81 binding takes place through the E2core glycoprotein. In this research work we have elucidated the molecular mechanisms that make CD81 and E2 respond to the environmental conditions that take place in the endosomes, in particular, pH. In the case of CD81, these studies have allowed to decipher that pH drives a conformational change (from close to open) in the head subdomain orchestrated by the titration of distal and solvent exposed residues D139 and E188, which are able to regulate the dynamics of the solvent around the entire protein by changing their own interaction with water. The implications of this conformational change in the function of tetraspanin CD81 in the endosomal pathway are still yet to be clarified, but we hypothesize that the particular response of CD81 to pH is the signal for the protein to exit the endosomal pathway and be recycled to the cellular membrane. In the case of E2, our work has elucidated that pH make the protein more stable, suggesting a possible active role during viral internalization and fusion, and not only receptor engagement. When these two proteins are studied together, CD81LEL and E2core in complex, their pH response mechanism is completely altered. CD81 does not sense pH anymore with its pH sensors D139 and E188 as their direct interaction with water is screened by the proximal interaction with E2, suggesting that HCV-E2 exploits the pH-sensing mechanism of CD81 to its own purposes. We hypothesize that this pH-sensing blockage serves the virus to keep bound to CD81 in the endosomes until fusion is accomplished. The pH-response of E2 is also altered in presence of CD81. The presence of CD81 induces changes in the pH-sensing of buried and solvent exposed residues in E2 which is translated in an alternating binding mechanism between both proteins. Also, the presence of CD81 primes conformational changes on the E2-CD81 binding loop and we hypothesize that this conformational change on the CD81 binding loop domain is necessary for the further fusion step in the endosomes. We hope that these findings about the HCV infection process aided by tetraspanin CD81 could help in the design of new antivirals that could block the pH-tuneable binding mechanism between both proteins or their respective pH-dependent conformational changes and so, be used as an alternative for those DAA resistant patients and as prophylactic therapy for high-risk populations.

The study of biomarkers and their detection in human fluids represents one of the best ways to improve the diagnosis and prevention of diseases. The use of human fluids for biomarker analysis can facilitate a friendly and non-invasive diagnosis of various pathologies that affect daily life. Early and accurate detection of these diseases is crucial, otherwise they can lead to serious conditions. In addition to its role in diagnosis, the study of biomarkers also contributes to improve treatments, as it helps to monitor response, identify new drug targets and explore therapeutic alternatives. Based on this premise, bibliographic knowledge, and previous studies of -omics technologies carried out by our research group, the present PhD thesis uses the immobilization of molecules on solid supports as a tool for the detection of biomarkers in human fluids. In this PhD thesis, we developed antibody microarrays (AbMAs) directed against human MMP-9 as a useful tool to detect this biomarker of ocular surface inflammation in tear samples. Moreover, multiplexed AbMAs were used to also detect the tear biomarkers CST4 and S100A6, providing a more complete panel of biomarkers for ocular diseases and improving patient diagnosis. In addition, we applied molecule immobilization technologies to develop a rapid test that detects collagenase activity in human synovial fluid samples by digesting an immobilized fluorescently labeled gelatin. This assay could aid in the diagnosis of diseases in which elevated extracellular matrix degradation is observed and could be used as a rapid test in primary health care. Additionally, we applied the microarray platform to study protein-protein interaction, specifically analyzing the interaction between PD-1 and PD-L1. This study demonstrates the functionality of microarrays not only in biomarker detection, but also in the analysis of protein dynamics. In conclusion, the results of the present PhD thesis deepen the existing knowledge of humoral biomarkers and provide novel approaches with potential application in the early diagnosis of diseases with an inflammatory component.

CaM binds to the calcium responsive domain (CRD) of voltage-gated potassium channel 7.2 (Kv7.2), transmitting calcium signaling to control its pore gating. In addition, CaM affects other functions, such as trafficking to the membrane and regulation of the stability of the distal tetramerization domain. In this dissertation, novel roles of CaM in Kv7.2 function are described, such as its involvement in redox regulation and in co-translational folding have been found. On the one hand, CaM regulates the function of Kv7.2 channel via a non-canonical interaction between the non-helical S2S3 linker and EF3 hand loop. This is critical for redox regulation. By acting through the CRD coupled to the S6 gate and through the voltage-sensing domain, CaM can influence gating in two opposing directions simultaneously. In addition, it has been found that CaM assists during co-translational folding of the Kv7.2 CRD in a calcium dependent manner. Thus, the recognition mechanism to the Kv7.2 occurs during co-translational folding, and provably involves a combination of conformational selection and induced fit mechanisms.

La enfermedad celíaca es una enfermedad inflamatoria crónica desarrollada en individuos con susceptibilidad genética por una respuesta inmune inadecuada al gluten de la dieta. Sin embargo, la respuesta inmunitaria inducida por el gluten derivada de la susceptibilidad genética explica menos del 50% de la heredabilidad, lo que sugiere que además del gluten podría haber factores ambientales adicionales que contribuyan al inicio de la respuesta inmunitaria. En base a esto, se han propuesto las infecciones virales como posibles agentes desencadenantes en la enfermedad celiaca. Con el fin de investigar la implicación de las infecciones virales en el desarrollo de la enfermedad celiaca, el proyecto actual se ha centrado en la búsqueda de determinantes funcionales relacionados con la respuesta inmunitaria innata contra las infecciones por virus de ARN. Más concretamente, en la presente tesis doctoral se ha analizado una nueva capa de regulación génica de IRF7 tras la combinación de infecciones virales entéricas y el consumo de gluten, y se ha estudiado la implicación de la metilación del ARN m6A en la regulación de este transcrito antiviral y su actividad aguas abajo en la vía de señalización del IFN-I.

Esta tesis doctoral, realizada en dos instituciones vascas de excelencia, CIC-bioGUNE y Tekniker, ha abordado un proyecto dividido en dos apartados complementarios: - El primer apartado, fue desarrollado principalmente en las instalaciones de Tekniker y posteriormente ensayado en CIC bioGUNE. Su objetivo era desarrollar un material polimérico avanzado cuya superficie de recubrimiento favorezca la nucleación y cristalización de proteínas de gran interés biomédico. La cristalografía de macromoléculas es actualmente la técnica más potente para determinar la estructura tridimensional de las proteínas a resolución atómica. Sin embargo, a pesar del enorme nivel de desarrollo técnico alcanzado, sigue estando limitada por la gran dificultad de obtener cristales que, tras su exposición a los rayos X, permitan obtener un patrón de difracción de alta resolución a partir del cual se pueda determinar la estructura de la proteína objetivo. Incluso hoy en día, el proceso de cristalización es un procedimiento de ensayo y error que requiere un enorme esfuerzo experimental y un elevado coste económico. Esta parte de la tesis se ha centrado en el desarrollo de topografías superficiales multiescalares (micro y submicrométricas) sobre policarbonato que actúan como un agente heteronucleante que favorece, potencia o induce el crecimiento de cristales de proteínas. El uso de estos polímeros permitió mejorar la resolución de algunos de los cristales que se describen en la siguiente sección. - La segunda sección del proyecto, fue desarrollada íntegramente en el CIC-bioGUNE. Su principal objetivo fue la caracterización cristalográfica de las dos enzimas de la vía de transulfuración inversa de dos patógenos humanos: Toxoplasma gondii y Pseudomonas aeruginosa. La vía de la transulfuración es un proceso metabólico que implica la interconversión de homocisteína y cisteína a través del intermediario cistationina. La primera enzima de la vía, la cistationina ß-sintasa, cataliza la condensación de la L-serina con la L-homocisteína para formar cistationina. La segunda enzima, la cistationina ¿-liasa, hidroliza la cistationina produciendo cisteína, ¿-cetobutirato y amonio. Ambas enzimas catalizan reacciones alternativas que conducen a la biosíntesis del sulfuro de hidrógeno (H2S), un importante gasotransmisor asociado a numerosas patologías, entre ellas los trastornos neurológicos y diversos cánceres. Recientemente, se ha demostrado que la inactivación de estas enzimas en bacterias multirresistentes y organismos patógenos aumenta su sensibilidad al estrés oxidativo y a diversos antibióticos (en el caso de las bacterias). Por lo tanto, la información estructural obtenida en este trabajo es clave para entender la implicación de la vía de transulfuración en la regulación de la homeostasis redox intracelular en patógenos y facilitará el diseño racional guiado por la estructura de inhibidores específicos.

Los macrófagos son un componente clave del sistema inmunitario innato, siendo de las primeras células en actuar frente a una infección mediante la ingestión y degradación de los microorganismos invasores. Además, participan en el mantenimiento de la homeostasis frente a bacterias comensales. Recientemente se ha descrito el concepto de inmunidad entrenada, reflejando la capacidad de las células del sistema inmunitario innato de adaptarse tras un primer estímulo, adquiriendo propiedades similares a las de la memoria inmunológica. Sin embargo, se desconoce la relevancia de este proceso en contextos en los que los macrófagos están continuamente expuestos a microorganismos vivos, como es el intestino. Así, el objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar la adaptación diferencial a largo plazo de los macrófagos frente a bacterias intestinales comensales y potencialmente patógenas, profundizando en las funciones efectoras y la reprogramación transcripcional y metabólica subyacente. Nuestros resultados muestran que los macrófagos entrenados con bacterias diversas comparten características comunes, incluyendo la disminución en la producción de citoquinas pro-inflamatorias, una capacidad fagocítica aumentada y un requerimiento glucolítico aumentado durante un segundo estímulo. Asimismo, describimos una reconfiguración parcial dependiente del potencial patogénico de las bacterias, así como de la viabilidad de las mismas. Adicionalmente, demostramos la generación de inmunidad entrenada central en ratón tras la ingesta puntual de microorganismos intestinales, tanto potencialmente patógenos como probióticos. Por último, descubrimos la necesidad de la microbiota residente, así como de sus metabolitos asociados, para la inducción de este proceso.

Immune checkpoint blockade therapies have enhanced cancer therapy in lung and renal cancers as well as melanoma. Most patients are stratified for anti-PD-1 or anti-CTLA-4 treatments based on their PD-L1 ligand expression that is currently assessed by traditional immunohistochemistry (IHC) approaches, which are subjective, lack quantitation and a dynamic range. We have developed a novel quantitative imaging platform, underpinned by time-resolved Förster resonance energy transfer (FRET) determined by frequency-domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to spatially quantitate these immune checkpoint interactions at a nanoscopic (<10nm) resolution. This assay is termed immune-FRET (iFRET). We validated the ability of iFRET to measure different immune checkpoints in patients with malignant melanoma and malignant non-small cell lung carcinoma (NSCLC). Here, iFRET was predictive of patient outcome whereas IHC approaches were not. This was then applied to a subset of colorectal cancer patients with bilateral lung metastases who failed to respond to classical treatments and therefore had their metastases treated by radiofrequency ablation (RFA). iFRET could detect differential PD-1/PD-L1 and CTLA-4/CD80 interaction states within patients and between patients. It was shown that neither CD80 nor PD-L1 expression correlated with checkpoint interaction in these patients. Moreover, a negative correlation was seen between PD-1/PD-L1 interactive states and intratumoral CD3+ density. Taken together, these results indicate a novel technique by which to assess immune checkpoint engagement in patient samples. The results from this multi-disciplinary investigation and thus the implementation of iFRET to carry out quantitative immune surveyance may change the way patients are selected for immunotherapies and may provide a mechanism by which to monitor their response to treatmen.

Los organismos presentes en ambientes extremos, y especialmente aquellos que viven en ambientes de hipersalinidad, han desarrollado mecanismos para compensar el estrés que somete sus moléculas, y en particular sus proteínas, a procesos de pérdida de estabilidad que inevitablemente conducen a la pérdida de función biológica. En esta tesis se estudia el efecto del ambiente, representado por conjuntos de moléculas orgánicas de pequeño tamaño y extractos celulares, sobre la estabilidad de las proteínas, apoyándose para ello en el mecanismo de adaptación al entorno observado en los organismos halófilos. También se estudia el impacto del medio sobre las propiedades cinéticas que caracterizan los procesos de oligomerización mediante intercambio de dominio.

Los análisis moleculares, tanto de genética como de microbiota intestinal, pueden ser herramientas de medición imprecisas por sí solas pero muy importantes en la determinación del perfil fisiológico individual de los deportistas. Pese a que la investigación actual en biología molecular aplicada al deporte es extensa, no encontramos una aplicación práctica diaria que sea válida en su aplicación para deportistas y entrenadores. Por ello, el presente trabajo determina como el aporte de datos desde los análisis moleculares al conjunto de valoraciones específicas de rendimiento puede contribuir importantemente a la determinación de la funcionalidad fenotípica de los deportistas. Conocer las posibles tendencias innatas asociadas al rendimiento físico a través del análisis genético puede ayudarnos a detectar particularidades individuales y mejorar los modelos de entrenamiento basados en la individualidad. Además, podemos especular como la capacidad adaptativa individual ante estímulos concretos influye en el rendimiento final deportivo. Por ejemplo, como la falta de una característica genética determinante para el desarrollo de un fenotipo puede ser sustituida con el desarrollo de otra particularidad fisiológica adaptativa. La capacidad plástica de la microbiota intestinal y su gran influencia en la salud y el desarrollo fisiológico nos aportan una gran capacidad de poder influir en el estado del deportista. Por ello, la detección y categorización de fenotipos de rendimiento asociados a la microbiota intestinal puede ser un objetivo a desarrollar en los siguientes años de investigación. De este modo, poder mejorar las herramientas de análisis molecular puede favorecer directamente la prevención de lesiones y mejorar el estado perceptivo frente a limitantes en la progresión del rendimiento en deportistas. La individualización del entrenamiento y la valoración del deportista desde la perspectiva molecular y fisiológica debe ser el futuro de la investigación y la aplicación para prevenir o reducir la pérdida de potencial biológico.

La hipertensión pulmonar (HP) es una condición compleja caracterizada por un incremento de la presión en las arterias de los pulmones, que puede dañar el lado derecho del corazón. Clásicamente se define por unos valores de presión arterial pulmonar media ¿25 mmHg. Con mayor frecuencia, la HP aparece como secuela de otra enfermedad, excepto en el caso de la HP del grupo I, hipertensión arterial pulmonar (HAP), que cursa con remodelación vascular pulmonar e incremento de la resistencia. El ventrículo derecho (VD) aumenta la fuerza de contracción para mantener el flujo sanguíneo, lo que acaba provocando su hipertrofia, y finalmente insuficiencia cardíaca. A nivel mundial se estima que casi el 1% de la población sufre de HP. A pesar de ello, sigue siendo una enfermedad mortal. Los síntomas incluyen dificultad respiratoria, fatiga, dolor en el pecho, aumento de la frecuencia cardíaca, y en casos más avanzados, mareos, síncopes y edema. Los principales métodos de diagnóstico comprenden el ecocardiograma como herramienta de cribado no invasiva y el cateterismo cardíaco derecho para establecer un diagnóstico definitivo. Dada la importancia del diagnóstico precoz en el manejo de la enfermedad, se necesita más investigación para refinar una técnica no invasiva y específica, capaz de detectar la HP en una etapa temprana. Como aún no hay cura, la terapia se dirige a paliar los síntomas y retrasar la progresión de la enfermedad. En este sentido, las intervenciones en el estilo de vida están ganando relevancia como tratamiento de apoyo de la enfermedad, entre las que se incluye la práctica de ejercicio físico. Sin embargo, sigue habiendo muchos aspectos desconocidos de la HP, y, a pesar de los avances, la falta de comprensión de la enfermedad puede obstaculizar la cura. Nos hemos centrado en algunos elementos clave de la patogénesis de la HAP, como la inflamación, la hipoxia y las alteraciones metabólicas, con el fin de analizar cómo afectan a la patología. La tesis se divide en 5 capítulos en los que se han llevado a cabo diferentes intervenciones en modelos preclínicos de roedores: i) se valoró la influencia de la actividad físicas en el fenotipo de la HP, y se observó que protege frente algunas de las manifestaciones típicas de la HP; ii) se evaluó el uso de que 68Ga-IONP-citrato-cFLF, una sonda radiomarcada con afinidad por los neutrófilos en dos modelos de HP, concluyendo que es capaz de detectar la presencia diferencial de inflamación neutrofílica in vivo en distintos modelos de HP; iii) se indagó en los efectos de la 2-deoxyglucosa (2DG) mediante un estudio proteómico, y se determinó que el tratamiento con 2DG atenúa los biomarcadores asociados a la HP, posiblemente a través de la preservación del metabolismo energético del miocardio; iv) se determinaron las consecuencias fenotípicas (pulmonares y cardíacas) de la modulación de la función mitocondrial mediante agentes químicos, observando que las alteraciones de la función mitocondrial impactan en los principales marcadores de HP; v) por último, se valoraron los efectos de la manipulación de la señalización de hipoxia a través de la peptidasa específica de la ubiquitina 11 (USP11), determinando que la inhibición de USP11 podría ofrecer cierta protección específica del sexo contra el desarrollo del fenotipo asociado al HP.

La serina puede sintetizarse a través de una vía conservada, comenzando por el intermediario glucolítico 3-fosfoglicerato (PGA). Este último es oxidado por la primera enzima de esta vía, la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), en 3-fosfohidroxipiruvato (PHP). Aunque PHGDH siempre se ha considerado una deshidrogenasa clásica dependiente de NAD, recientemente se ha demostrado que en ciertos organismos, actúa como una transhidrogenasa utilizando ¿-ketoglutarato en lugar de NAD+ como aceptor final de electrones, produciendo tanto PHP como D-2-hidroxiglutarato (2HG). En este estudio, realizamos una detallada descripcion de la PHGDH de Saccharomyces cerevisiae, Ser33. Utilizando al proteína recombinante de Ser33, pudimos obtener cinco estructuras cristalinas diferentes de la enzima, a saber, sin ligando y en complejos con PHP, PGA, 2HG, serina, así como 2HG más serina. Además, se realizaron ensayos in vitro con varios mutantes, lo que permitió profundizar, a nivel molecular, en los mecanismos catalíticos y reguladores de Ser33. Este análisis estructural-funcional de Ser33 proporciona una base sólida para comprender mejor el mecanismo transhidrogenasa recientemente identificado de las enzimas PHGDH de tipo II.

Aedes aegypti bacteria-responsive protein 1 (AgBR1) y neutrophil stimulating factor 1 (NeSt1) son dos proteínas salivales del mosquito Aedes aegypti que actúan como potenciadoras de la infección del virus Zika (ZIKV). En este trabajo se ha realizado el análisis estructural de AgBR1 y NeSt1 con el fin de relacionar su estructura con la actividad inmunomoduladora que presentan in vivo. La estructura cristalina de AgBR1 ha sido resuelta mediante cristalografía de rayos-X a una resolución de 1,25 Å mediante reemplazo molecular (MR). La estructura general de la proteína muestra el clásico barril TIM (barril ¿ß8), que pertenece, entre otros, a la familia 18 de las glicosil hidrolasas. La estructura de NeSt1 también ha sido resuelta mediante MR utilizando como modelo la reciente estructura del homólogo LIPS-2 con un 63% (los datos de la estructura no se muestran aquí). Desde el punto de vista funcional, las dos proteínas salivales de mosquito se internalizan en el citoplasma de los macrófagos derivados de la médula ósea de ratón (BMDM). La internalización sugiere la unión de las proteínas a un receptor. Los ensayos de estimulación apoyan que ambas las proteínas de las glándulas salivales del mosquito activan la respuesta inmune innata y la formación de fagosomas (solo por AgBR1, aunque NeSt1 también participa en este proceso) en células BMDM. Los receptores FCGR2A y TLR4 han sido identificados como reguladores aguas arriba de ambas proteínas salivales. Este podría ser un mecanismo empleado por las proteínas para acceder al citoplasma de los macrófagos murinos mediante la formación de fagosomas, activando así a los macrófagos.

La presente tesis se centra en la verificación experimental de las utilidades del NT como un sensor molecular. La membrana, tanto la plasmática como la que rodea al sistema endomembranoso, es un sistema dinámico, que sufre importantes remodelaciones y deformaciones, claves en numerosos procesos celulares. Estas remodelaciones son producto del efecto colectivo de proteínas y lípidos sobre la membrana. Y aunque es posible estudiar el efecto colectivo de estas moléculas sobre la memrbana y sus propiedades mecánicas, es difícil caracterizar el efecto que moléculas individuales de proteína tienen sobre la membrana, La presente tesis propone el desarrollo de un sensor molecular basado en el sistema de nanotubos lipídicos ultracortos, que permita determinar y caracterizar el efecto colectivo de lípidos y proteínas sobre la membrana y llegar incluso a discriminar, si no moléculas individuales, sí pequeños oligómeros de proteína.. Así, los objetivos del presente trabajo son los siguientes: Crear nanotubos de tamaño molecular a partir de diferentes composiciones lipídicas Caracterizar el efecto de lípidos sobre las propiedades mecánicas de estos NTs Comprobar la capacidad de los NTs de actuar como sensores moleculares (para proteínas y lípidos) Desarrollar procedimientos electroforéticos para incorporar moléculas a esos NTs

Las vesículas extracelulares (EVs) son pequeñas partículas delimitadas por membranas lipídicas que las células generan y secretan al espacio extracelular. Su función principal es facilitar la comunicación intracelular, y actuar como portadoras de una amplia gama de moléculas, incluyendo proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Se ha observado que el daño hepático afecta de manera significativa la composición proteica de las EVs liberadas, y se ha constatado que las EVs secretadas por hepatocitos contienen enzimas activas, como la Catecol-O-metiltransferasa (COMT), una proteína previamente identificada como biomarcador de daño hepático. El objetivo principal de la tesis es investigar la composición de las EVs derivadas del hígado y su posible impacto en los órganos receptores, además de explorar la posible implicación de la COMT en dichos efectos. Este estudio ha revelado que los hepatocitos bajo condiciones de síndrome metabólico acumulan lípidos que son liberados a través de EVs en cultivo, alterando también significativamente el contenido lipídico de las EVs, enriqueciendo las especies de triglicéridos. A través de estudios In Vivo se han observado interacciones mediada por EVs entre el cerebro y el hígado aumentadas con dieta grasa. En relación con el estudio de la COMT, se ha encontrado una mayor expresión de esta enzima en las mitocondrias, y se ha determinado que la vía endocítica y el transporte vesicular desempeñan un papel importante en la regulación de la localización subcelular de la COMT. En resumen, se ha establecido una estrecha relación entre la COMT y las mitocondrias, evidenciándose una desviación hacia estas últimas al bloquear distintas vías de tráfico vesicular.

Origins of life (OL) research, as the name suggests, is concerned with the question of how cellular organisms could have develop, starting from complex chemical reaction systems, i.e. the transition from geo-chemistry to bio-chemistry. This vast and interdisciplinary research field has been dominated for many years by rather reductionistic approaches, that were mainly searching for a primordial type of biopolymer. However, in recent years, a shift towards a more systems oriented view of life and its origins has taken place, spurred by the emergence of fields like `systems biology¿ and `systems chemistry¿. Rather than focusing on a single type of biomolecule or biochemical reaction pathway, these new approaches target the way in which molecular components and transformation processes are organized within biological (and proto-biological) systems. On these lines, the motivation behind this dissertation is to introduce the idea of `minimal metabolism¿ (MM) as a heuristic construct that lies at the interface between chemistry and biology. So this theoretical proposal should not be taken as a final or complete characterization of metabolism, but as a particular contemporary way of thinking about it to encourage further research. With that aim, an attempt is made at modelling such a minimal metabolic system. This is achieved through the implementation of two different types of computational models, each focusing on a certain aspect associated with MM. The results of these two modelling approaches are then compared and critically discussed. Finally, a general outlook and perspective for future research on MM, and OL in general, is given.

Dada la complejidad del metabolismo hepático, es imprescindible reducir dicha complejidad al mínimo de información prescindible. En este contexto, se propone que el metabolismo puede describirse cuantitativamente centrándose en la fracción fosforilada del metabolismo, el ¿fosforoma¿, en el que los metabolitos fosforilados desempeñan un papel importante en una amplia gama de procesos catabólicos y anabólicos. Para la cuantificación de los metabolitos fosforilados, la 31P-Resonancia Magnética Nuclear (31P-RMN) ofrece ventajas potenciales que incluyen una alta sensibilidad y una amplia dispersión de la señal que evita la superposición de señales. Por lo tanto, en esta tesis se desarrolla un método basado en 31P-RMN para estudiar el fósforo del hígado en ratones mediante la identificación y cuantificación simultánea de múltiples metabolitos fosforilados hidrófilos e hidrófobos. Hasta ahora, esta plataforma ha proporcionado la concentración absoluta de hasta 54 metabolitos, obteniéndose una instantánea del metabolismo hepático en salud, enfermedad y/o respuesta al tratamiento, que se correlaciona con la histología del hígado y proporciona información mecanística.

enfoques terapéuticos del CaP metastásico, es necesario identificar marcadores moleculares pronósticos de recaída y comprender los mecanismos biológicos que impulsan el desarrollo de capacidades agresivas en las células cancerosas de la próstata. En los últimos años, el uso de datos transcriptómicos derivados de muestras de cáncer se ha convertido en un recurso importante para clasificar, estratificar e identificar genes clínicamente relevantes en los tumores y se ha demostrado que la desregulación de la expresión génica es un nodo clave para la patogénesis y progresión del cáncer. Uno de los logros previos de nuestro laboratorio en este campo fue descubrir la actividad supresora de tumores y metástasis de PGC1¿ en el CaP. PGC1¿ es un regulador maestro del metabolismo celular y se encontró que su expresión, así como su programa transcripcional dependiente de ERR¿, están disminuidos en pacientes con CaP y se asocian con la agresividad y el pronóstico de la enfermedad. Mediante la generación de un modelo de ratón transgénico con la deleción condicional de Pgc1a y Pten en el epitelio prostático murino, se demostró que la disminución de la expresión de PGC1¿ en el CaP contribuye a la progresión de la enfermedad. Además, se descubrió que la reexpresión de PGC1¿ en células agresivas de CaP inhibe la proliferación, invasión, migración y metástasis, tanto in vitro como in vivo, dependiendo de ERR¿. También se observó que la alteración transcripcional de PGC1¿ afecta la adhesión celular y las reorganizaciones citoesqueléticas, lo que indica que sus efectos van más allá de la regulación de vías metabólicas. La comunicación celular, que abarca todos los tipos de células y la matriz extracelular (MEC) presente en un determinado microentorno, es crucial para el correcto funcionamiento de los procesos biológicos. La comunicación se puede clasificar en directa, cuando hay una interacción célula-célula o célula-MEC, o indirecta, cuando se realiza a través de moléculas secretadas. El contacto entre las integrinas y la MEC es el principal mecanismo de comunicación directa entre las células y el microentorno. La señalización a través de las integrinas puede influir en la migración, invasión, proliferación y supervivencia celular en el CaP. Las integrinas ligadas están asociadas con la migración e invasión celular, y regulan la actividad de las enzimas degradadoras de la MEC. Por otro lado, las integrinas no ligadas pueden inducir apoptosis y afectar negativamente la supervivencia de las células tumorales. Estas proteínas también están implicadas en la resistencia a la terapia hormonal en el CaP, y sus niveles de expresión se correlacionan con la agresividad y el estadio del tumor. Hormonas, factores de crecimiento, citocinas, glicoproteínas y proteasas son algunos ejemplos de moléculas secretadas que permiten la comunicación celular indirecta. En el CaP, los cambios en el secretoma están relacionados con la progresión y la pérdida de supresores de tumores y genes involucrados en las adhesiones célula-célula/matriz. La mayoría de los estudios sobre el secretoma del CaP tienen como objetivo encontrar nuevos biomarcadores para la enfermedad. CTHRC1 es una glicoproteína secretada de 28 kDa que, en condiciones fisiológicas normales, se expresa principalmente durante el desarrollo embrionario. También está fuertemente correlacionada con el crecimiento del cartílago y el hueso, y en el cuerpo adulto su expresión está más restringida, principalmente en el corazón, las arterias renales y la matriz ósea y el periostio. Los miofibroblastos y las células musculares lisas, entre otros tipos celulares del estroma, como las células endoteliales, presentan una expresión elevada y detectable de CTHRC1. En el cáncer, la expresión de CTHRC1 suele estar aumentada y esta sobreexpresión contribuye a la proliferación, invasión y metástasis de las células cancerosas. Se han asociado diferentes vías de señalización con la desregulación de CTHRC1, como las vías de TGFß y Wnt, así como integrina/FAK, MEK/ERK, PI3K/AKT/ERK, entre otras. Además, se ha demostrado que CTHRC1 está regulada por microARNs (miARNs) en varios tipos de cáncer. En el CaP, la expresión de CTHRC1 está aumentada en pacientes con cáncer en comparación con tejido normal. Se ha observado que la sobreexpresión de CTHRC1 se asocia con una menor tasa de supervivencia libre de enfermedad (SLE) y con recurrencia en los pacientes. En estudios in vitro, la reducción de la expresión de CTHRC1 en células de CaP agresivas resultó en una disminución de la proliferación, migración e invasión celular. Hipótesis y objetivos Los datos previos del laboratorio y lo descrito antes, nos han llevado a postular que "la desregulación transcripcional de los genes que gobiernan la comunicación celular es una fuerza impulsora en la adquisición de propiedades agresivas por parte de las células del CaP y, por tanto, tendrá un impacto funcional en la biología y progresión de la enfermedad". Para poner a prueba esta hipótesis, nos proponemos los siguientes objetivos: Objetivo 1. Evaluar la regulación de los jugadores directos e indirectos de la comunicación celular en un modelo de supresión tumoral del CaP impulsado por el eje transcripcional PGC1¿-ERR¿. Objetivo 1.1. Estudiar el efecto de PGC1¿-ERR¿ en la regulación transcripcional de las integrinas y su cascada de señalización, mediadores clave de la comunicación celular directa con la matriz extracelular (ECM). Objetivo 1.2. Estudiar la regulación de la proteína secretada CTHRC1 por el eje transcripcional PGC1¿-ERR¿ y su contribución al fenotipo supresor tumoral de PGC1¿. Objetivo 2. Explorar el potencial de los genes relacionados con la comunicación celular como impulsores de la patogénesis/agresividad del CaP. Objetivo 2.1. Identificar genes relevantes relacionados con la comunicación celular para la progresión y el pronóstico del CaP a partir del análisis in silico de genes relacionados con el secretoma y el matrisoma. Objetivo 2.2. Descifrar el mecanismo molecular de la desregulación de CTHRC1. Objetivo 2.3. Evaluar la contribución de CTHRC1 a la patogénesis del CaP mediante perturbaciones genéticas. Objetivo 2.4. Descubrir el mecanismo molecular subyacente al papel funcional de CTHRC1 en el CaP. Resultados y Discusión 1.1 Investigación de la desregulación transcripcional de genes de comunicación celular directa en un modelo de supresión tumoral de CaP impulsado por PGC1¿. Con el objetivo de evaluar la desregulación transcripcional de genes relacionados con la comunicación celular directa en el CaP, utilizamos un modelo clínicamente relevante de la enfermedad que ya estaba disponible en nuestro laboratorio. Este modelo se basa en la reexpresión del regulador transcripcional maestro PGC1¿ en células de CaP PC3 (PC3_PGC1¿), e imita un escenario de supresión tumoral en el que se reducen significativamente características agresivas como la proliferación, invasión y metástasis. Previamente, en el laboratorio se realizó y analizó un experimento de secuenciación de ARN con células PC3_PGC1. Previamente, realizamos un experimento de secuenciación de ARN con células PC3_PGC1¿ y analizamos el enriquecimiento funcional de los datos. Este análisis reveló que la reexpresión de PGC1¿ en células PC3 agresivas induce la regulación transcripcional de genes relacionados con vías metabólicas y la vía del interferón. Además, en concordancia con la disminución previamente observada en la proliferación celular por nuestro laboratorio, la reexpresión de PGC1¿ también provoca una regulación transcripcional a la baja de genes relacionados funcionalmente con el ciclo celular, la señalización de integrinas, el metabolismo del colágeno y la MEC. Estas vías, especialmente las de señalización de integrinas y MEC, resultaron muy interesantes debido a su implicación en la comunicación celular y su papel importante en la regulación del proceso. Por lo tanto, decidimos investigar más a fondo la regulación de estas vías por PGC1¿ Observamos una disminución en la expresión de ARNm de diferentes integrinas (ITGA1, ITGA2, ITGA3 e ITGB4) y una reducción en los niveles proteicos de ITGß1 e ITGß4 después de la reexpresión de PGC1¿. Ampliamos el análisis a algunas de las proteínas asociadas con las integrinas y, aunque no encontramos diferencias en la expresión de talina y vinculina a nivel de ARNm, sí observamos cambios en la expresión de caveolina 1, un miembro de la familia de genes de la caveolina que regula positivamente la señalización de las integrinas y promueve la migración y la invasión celular. Investigamos la cascada de señalización FAK-SRC, una de las principales vías activadas por las integrinas, en nuestro sistema in vitro monitoreando el estado de fosforilación de FAK, SRC y cofilina y observamos que la reexpresión de PGC1¿ en células PC3 inducía una marcada y consistente reducción en la fosforilación de SRC y cofilina. Para confirmar si estas alteraciones también se mantenían in vivo, utilizamos muestras de tumores xenoinjertados generados previamente en el laboratorio mediante la inyección subcutánea de células PC3 expresantes y no expresantes de PGC1¿ en ratones nude. Confirmamos la reducción de la expresión de ITGB4 y caveolina tanto a nivel de ARNm como de proteínas. Aunque no detectamos una reducción en la expresión de ITGB1 a nivel de ARNm, los niveles de proteína disminuyeron notablemente, al igual que la fosforilación de SRC y cofilina. Dado que ya habíamos demostrado previamente que el efecto supresor de tumores y metástasis de PGC1¿ depende de su socio transcripcional, ERR¿, nos preguntamos si ERR¿ también estaba implicado en las alteraciones observadas en la expresión y señalización de las integrinas. Utilizamos un modelo in vitro previamente generado en el laboratorio en el que se eliminó ERR¿ en de forma constitutiva en células PC3 junto con la reexpresión inducible de PGC1¿ utilizando la tecnología CRISPR. Observamos que en ausencia de ERR¿, PGC1¿ no fue capaz de reducir la expresión de las integrinas, caveolina y la fosforilación de SRC y cofilina tanto in vitro como in vivo. 1.2 Investigación del papel del eje transcripcional PGC1¿/ERR¿ en la regulación de genes de comunicación celular indirecta en un modelo de supresión tumoral de CaP. Con el fin de identificar proteínas secretadas relevantes que pudieran mediar en la comunicación celular indirecta y que también estuvieran desreguladas transcripcionalmente por PGC1¿, llevamos a cabo un análisis integrado de los datos de secuenciación de ARN y proteómica del secretoma en nuestro sistema in vitro. Identificamos CTHRC1 como la proteína más desregulada y la seleccionamos para explorar su posible papel como mediador del efecto de PGC1¿. Evaluamos su expresión a nivel de ARNm y proteínas en células PC3_PGC1¿ y encontramos que la reexpresión de PGC1¿ redujo significativamente sus niveles. Además confirmamos que la desregulación de CTHRC1 por PGC1¿ dependía de su socio transcripcional ERR¿ y que esto ocurría también in vivo. Realizamos un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el análisis de los datos obtenidos mostró que PGC1¿ se une al promotor de CTHRC1. Dado que se ha sugerido que CTHRC1 desempeña funciones en la proliferación, migración e invasión celular, nos preguntamos si podría ser un posible mediador de los efectos antiproliferativos intrínsecos y extrínsecos del eje transcripcional PGC1¿/ERR¿. Para investigar esto, generamos células PC3_PGC1¿ con sobreexpresión inducible por doxiciclina de CTHRC1 (PC3_PGC1¿ -CTHRC1) y, despues de confirmar que el sistema funcionaba correctamente, evaluamos la contribución de CTHRC1 al fenotipo antiproliferativo de PGC1¿. Observamos que restaurar la expresión de CTHRC1 no fue capaz de revertir la fuerte inhibición de la proliferación inducida por PGC1¿, ni pudo rescatar la migración y la capacidad invasiva de las celulas PC3. 2.1 Identificación de genes relevantes relacionados con la comunicación celular para la progresión y el pronóstico del CaP. Para seleccionar candidatos relacionados con la comunicación celular en el CaP, adoptamos dos enfoques diferentes basados en el análisis de la comunicación directa e indirecta. En el caso de la comunicación celular indirecta a través de la secreción, tomamos la lista de genes que codifican proteínas humanas secretadas. Para la comunicación celular directa, nos enfocamos en la comunicación entre las células y la MEC, utilizando la lista del Matrisoma. En ambos enfoques, seleccionamos genes que cumplieran dos criterios: (i) su expresión de ARNm debe estar desregulada en más de la mitad de los conjuntos de datos de CaP analizados en comparación con las muestras normales, y (ii) su expresión debe estar consistentemente asociada con la SLE. En el primer análisis, identificamos 9 genes que cumplían los criterios: 8 genes con expresión regulada a la baja en el CaP (CCK, CRISPLD2, DPT, EDN3, FBLN1, PTGDS, SPOCK3 y TGFB3) y 1 gen con expresión regulada al alza (CTHRC1). En el segundo analysis, obtuvimos 19: 13 genes con expresión regulada a la baja en el CaP (ANGPT1, ANXA1, CHRDL1, CRISPLD2, DPT, FBLN1, LGALS3, NRG2, OGN, PTN, SPOCK3, SRPX y TGFB3) y 6 genes con expresión regulada al alza (ADAMTS2, ASPN, BGN, COL10A1, CTHRC1 y SPP1). Se seleccionó CTHRC1 como el candidato principal debido a su alta asociación con la SLE y a que ya se había identificado previamente como un gen de interés en el análisis del secretoma de nuestro modelo de CaP supresor de tumores. Además, considerando posibles terapias directas, sería más factible dirigirse a un candidato con expresión regulada al alza que a uno con expresión regulada a la baja, y en ese momento (2018) no había literatura sobre la relación entre CTHRC1 y el CaP. 2.2. Estudio de la desregulación de CTHRC1 en el CaP. En el CaP, observamos que la expresión de CTHRC1 estaba aumentada en muestras de pacientes con tumores en comparación con las muestras normales, y también encontramos una correlación positiva entre los niveles de expresión de CTHRC1 y la agresividad del CaP. Este resultado se mantuvo cuando dividimos a los pacientes en grupos según la recurrencia de la enfermedad. Desde el análisis inicial, sabíamos que CTHRC1 estaba asociado con SLE en el CaP y, este potencial de CTHRC1 para estratificar a los pacientes podría utilizarse en la clínica como biomarcador para identificar a los pacientes que recurrirán de los que no lo harán. A través de estudios de secuenciación de ARN de células individuales (sc-ARN), observamos que la señal de ARNm de CTHRC1 se detectaba principalmente en fibroblastos y células endoteliales de las lesiones de CaP, aunque también estaba presente en el compartimento de células epiteliales. Para confirmar estos resultados a nivel proteico, realizamos tinciones inmunohistoquímicas de CTHRC1 en muestras de CaP e hiperplasia prostática benigna, y encontramos que la expresión de CTHRC1 en el compartimento epitelial era mayor en el CaP que en la hiperplasia prostática benigna. Además, investigamos la expresión de CTHRC1 en un panel de líneas celulares epiteliales de CaP disponibles en nuestro laboratorio y observamos que las líneas celulares DU145 y PC3 (negativas para el receptor de andrógenos) mostraron una mayor expresión de CTHRC1 tanto a nivel de ARNm como de proteína, mientras que las líneas celulares LNCaP y C4-2 (positivas para el receptor de andrógenos) mostraron una menor expresión. Dado que CTHRC1 está sobreexpresado en el CaP, investigamos si esta sobreexpresión estaba asociada con alteraciones genómicas. Nuestro análisis reveló que CTHRC1 está amplificado en pacientes con CaP con frecuencias variables (5-30%), pero encontramos que en estos pacientes, en comparación con los pacientes con un número normal de copias del gen, la sobreexpresión de ARNm de CTHRC1 era moderada y no consistente ni significativa. La expresión de CTHRC1 está regulada por diferentes factores de transcripción en distintos escenarios biológicos pero antes de investigar estos posibles mecanismos de regulación en nuestro sistema, nos enfocamos en el papel potencial del receptor de andrógenos (RA) en la modulación de la expresión de CTHRC1 en el CaP. Tomamos esta dirección porque al analizar la expresión de la proteína CTHRC1 en el panel de líneas celulares, observamos que CTHRC1 estaba altamente expresada en las células que no expresan el RA (DU145 y PC3) y poco expresada en las líneas celulares que son positivas/sensibles al RA (LNCaP, C4-2, 22RV1).Realizamos varios análisis para investigar la relación entre la actividad transcripcional del RA y la expresión de ARNm de CTHRC1 en conjuntos de datos de pacientes con CaP, y encontramos que RA regula negativamente la expresión de nuestro candidato. También realizamos experimentos in vitro utilizando células RA-positivas (LNCaP y C4-2), donde monitoreamos la expresión de CTHRC1 en respuesta a la manipulación de la actividad del RA mediante el tratamiento con dihidrotestosterona (DHT) para activarlo y enzalutamida (Enza) para bloquearlo. Los resultados indicaron que existe una correlación negativa entre la actividad del RA y la expresión de ARNm de CTHRC1, pero se requiren más experimentos para comprender cómo el RA reprime a CTHRC1. 2.3. Evaluar la contribución de CTHRC1 a la patogénesis del CaP mediante perturbaciones genéticas. Basándonos en los resultados obtenidos del análisis de la expresión de CTHRC1 en el panel de líneas celulares de CaP, seleccionamos las células LNCaP para la sobreexpresión de CTHRC1 y las células DU145 y PC3 para reducir sus niveles, con el objetivo de estudiar en detalle la contribución de CTHRC1 a la agresividad del CaP. Generamos una línea celular LNCaP que sobreexpresaba de manera estable el gen exógeno humano CTHRC1 de forma inducible por doxiciclina (LNCaP TRIPZ_CTHRC1), y validamos tanto a nivel de ARNm como de proteína el aumento de CTHRC1. Luego, realizamos diferentes ensayos biológicos para evaluar el impacto de la reintroducción de CTHRC1 en las propiedades agresivas de las células de CaP y observamos que no tuvo ningún efecto en la proliferación ni en sus capacidades invasivas. Para investigar el efecto de reducir los altos niveles de expresión de CTHRC1 detectados en las células de CaP, utilizamos dos métodos distintos en las células PC3 y DU145. Utilizamos la tecnología CRISPR/CAS9 para eliminar el gen CTHRC1 y un sistema inducible de ARN de cadena corta para silenciar su expresión. Con ambas metodologías, observamos que la reducción de los niveles de CTHRC1 inducia una disminución en la proliferación, más notable en las células DU145, y que no estaba asociada a la activación de apoptosis, pero si a una alteración en el ciclo celular. También encontramos una disminución significativa en la capacidad migratoria de las células DU145 con CTHRC1 silenciado, pero no hubo cambios en su capacidad invasiva. Realizamos un ensayo de degradación de gelatina en colaboración con el laboratorio del Dr. Bravo-Cordero para investigar el papel de CTHRC1 en la remodelación de la matriz extracelular (MEC). Sin embargo, al analizar las imágenes de nuestras muestras, no se detectaron diferencias en la degradación al silenciar CTHRC1. Curiosamente, observamos que las células DU145 con CTHRC1 silenciada tenían un tamaño más pequeño en comparación con las células de control. Además, estas células mostraron un patrón de movimiento celular diferente, ya que se movían más lentamente y recorrían distancias más cortas. Con el objetivo de investigar cómo las alteraciones de CTHRC1 en las células epiteliales del CaP afectan la composición y organización de la matriz extracelular, planeamos generar tumores mediante el ensayo de la membrana corioalantoica (CAM) utilizando nuestras células DU145_shCTHRC1. Desafortunadamente, a pesar de múltiples intentos con diferentes números de células y agregando Matrigel, no pudimos generar tumores. 2.4. Desentrañar el mecanismo molecular subyacente al papel funcional de CTHRC1 en el CaP Con el fin de comprender los eventos moleculares asociados a la expresión diferencial de CTHRC1 tanto en pacientes como en líneas celulares in vitro, realizamos diversos enfoques analíticos que incluyeron análisis proteómicos y transcriptómicos. Tras el silenciamiento de CTHRC1, detectamos más de 200 proteínas expresadas de manera significativamente diferente en las células DU145. Realizamos un análisis de enriquecimiento funcional con Cacertool y encontramos diversas vías alteradas relacionadas con el ciclo celular, el interferón y el sistema inmunitario. Además, el análisis de enriquecimiento con el software IPA reveló alteraciones en vías relacionadas con las uniones celulares, incluyendo las uniones estrechas, comunicantes y adherentes, que están asociadas con el movimiento celular, la migración y la invasión, y que concuerdan con los efectos biológicos de la reducción de CTHRC1 que observamos. Dado que CTHRC1 es una proteína secretada, realizamos un análisis proteómico de los medios condicionados de las células DU145_shCTHRC1 para investigar el impacto de la desregulación intrínseca de CTHRC1 en la comunicación celular a través de factores secretados. Detectamos 85 proteínas que estaban secretadas de forma diferente y del análisis de enriquecimiento, encontramos que la mayoría de las proteínas alteradas estaban relacionadas con la organización y remodelación de la MEC, así como con la respuesta inmune. Nos preguntamos si las alteraciones que encontramos a nivel de proteínas se debían a una alteración transcripcional y para investigar esto, realizamos un análisis de secuenciación de ARN en nuestro sistema. Encontramos más de 5000 genes alterados en las diferentes condiciones y observamos que las categorías más enriquecidas entre los genes expresados diferencialmente estaban relacionadas con el ciclo celular, la senescencia y diferentes vías de señalización como NOTCH, EGFR, FGFR, RAS-ERK y TGFß, entre otras. Para verificar si las alteraciones identificadas a partir de los datos de proteómica y transcriptómica in vitro también se reflejaban en pacientes con CaP, realizamos un análisis de correlación entre los genes comúnmente alterados en ambas condiciones y CTHRC1 en diferentes conjuntos de datos de pacientes con CaP. Observamos que solo 5 genes (SLC16A3, AKR1C3, CRYBG1, PLXNB2 y SORD) estaban tanto alterados in vitro como correlacionados con CTHRC1 en pacientes con tumor primario, y 5 genes en metástasis (SLC16A3, DPYSL2, IFIT3, ISG15 y PLAU). Fue interesante destacar que 2 de los 5 genes identificados en la metástasis, IFIT3 e ISG15, están involucrados en la vía del interferón. Discusión general. La comunicación entre las células cancerosas y la MEC a través de las integrinas desempeña un papel crucial en la progresión del CaP. La alteración de las integrinas puede afectar el comportamiento tumoral y su implicación en la dormancia y la respuesta a tratamientos es un área de investigación activa. Observamos una disminución en la expresión de integrinas específicas al volver a expresar PGC1¿ en células agresivas de CaP, lo que conlleva una deteriorada señalización de FAK. Sin embargo, la correlación entre PGC1¿ y la expresión de integrinas en los datos de pacientes fue inconsistente, lo que resalta la complejidad de la heterogeneidad del CaP. Las integrinas, junto con la composición y propiedades físicas de la MEC, están implicadas en la regulación de la adquisición de propiedades agresivas de las células tumorales y en la dormancia. Los cambios en la rigidez de la MEC y las alteraciones en la activación de las integrinas pueden influir en las decisiones del destino celular y en el mantenimiento de las células cancerosas en estado de dormancia. Se ha demostrado que las vías de señalización mediadas por las integrinas están relacionadas con la transición de un estado de dormancia a lesiones metastásicas proliferativas. Es posible que existan diferentes subpoblaciones de células de CaP con niveles variables de expresión de PGC1¿, lo cual influye en la regulación de las integrinas y en el comportamiento tumoral. Se plantea la hipótesis de que la alteración en la expresión de las integrinas inducida por PGC1¿ promueve un estado de dormancia en las células cancerosas y, la restauración de su expresión podría potencialmente reactivar a las células en estado de dormancia. El direccionamiento de las integrinas ha surgido como una estrategia terapéutica prometedora para interrumpir la supervivencia y la metástasis de las células cancerosas. Se han llevado a cabo ensayos clínicos para explorar terapias dirigidas a las integrinas en diversos tipos de cáncer, incluido el CaP. Por ejemplo, el abituzumab, un anticuerpo monoclonal que se dirige a las integrinas ¿v, ha demostrado su eficacia en la inhibición de la metástasis y la progresión ósea en pacientes con CaP. Además, el análisis de genes relacionados con la comunicación celular nos ha permitido identificar a CTHRC1 como un posible mediador de la comunicación celular indirecta en el CaP. Se han investigado los impactos potenciales de CTHRC1 como oncogén en aspectos clave de la agresividad del CaP, incluyendo la proliferación celular, la migración, la invasión y su posible participación en la dinámica del citoesqueleto y la remodelación de la MEC. Uno de los hallazgos más destacados de este estudio es el potencial de CTHRC1 como biomarcador pronóstico en el CaP. Se ha observado una fuerte correlación entre altos niveles de expresión de CTHRC1 y un mal pronóstico en los pacientes. Esto sugiere que la detección de CTHRC1 en el suero de los pacientes de CaP, combinada con la prueba convencional del antígeno prostático específico (PSA), podría mejorar la detección y la predicción de resultados en esta enfermedad. Actualmente, la prueba del PSA tiene limitaciones y puede llevar a un sobrediagnóstico o a la omisión de cánceres agresivos debido a influencias no relacionadas con el cáncer. Por lo tanto, desarrollar una nueva prueba de diagnóstico que incluya la medición de CTHRC1 podría proporcionar resultados más precisos y confiables, permitiendo una mejor estratificación de riesgo y una toma de decisiones más precisa sobre el tratamiento. Otro hallazgo importante es la correlación inversa entre la expresión de CTHRC1 y la actividad del RA. Se ha observado que el RA inhibe la expresión de CTHRC1, lo que plantea consideraciones importantes en cuanto a las opciones de tratamiento para los pacientes con CaP. Habitualmente, estos pacientes reciben terapia deprivadora de andrógenos (ADT) para contrarrestar la activación excesiva de la señalización del RA. Sin embargo, si la inhibición del RA conduce a un aumento en la expresión de CTHRC1 y esta sobreexpresión se asocia con una enfermedad más agresiva, existe la preocupación de que el tratamiento estándar pueda empeorar inadvertidamente la condición del paciente. En consecuencia, podría ser necesario combinar la ADT con agentes que apunten específicamente a CTHRC1 para mitigar sus efectos perjudiciales. El desarrollo de terapias dirigidas a CTHRC1 puede llevar tiempo, especialmente en el caso del diseño de pequeñas moléculas dirigidas a esta proteína. Además, la naturaleza secretada de CTHRC1 plantea desafíos adicionales para su inhibición efectiva. Por lo tanto, se pueden explorar estrategias alternativas, como el uso de medicamentos existentes que interrumpen de la señalización de TGFß, un regulador de CTHRC1. Varios estudios han demostrado el potencial de los inhibidores de TGFß en ensayos preclínicos, como el uso de anticuerpos contra TGFß y inhibidores de la quinasa TßRI, como Galunisertib. La combinación de ADT con inhibidores de TGFß podría mejorar los resultados del tratamiento en pacientes con altos niveles de expresión de CTHRC1. Es importante destacar que CTHRC1 es una proteína secretada con el potencial de ejercer efectos en el microambiente tumoral y la MEC y su interacción con la MEC puede tener un impacto significativo en la progresión del cáncer. La MEC desempeña un papel fundamental en el desarrollo y la propagación de los tumores, y las señales biofísicas y bioquímicas originadas en la MEC asociada al tumor tienen un impacto importante en el comportamiento del cáncer. Por lo tanto, investigar la interacción entre CTHRC1 y la MEC podría proporcionar información valiosa sobre su papel en la progresión del CaP. Conclusiones Los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo de tesis validan nuestra hipótesis inicial y demuestran que la alteración transcripcional de genes relacionados con la comunicación celular tiene un impacto en las propiedades agresivas de las células de PCa. Las principales conclusiones de este estudio pueden resumirse de la siguiente manera: 1. La supresión tumoral impulsada por PGC1¿ se asocia a cambios significativos en la expresión de integrinas, mediadoras de la comunicación celular directa, tanto in vitro como in vivo. 2. La alteración de la expresión de integrinas tras la sobreexpresión de PGC1¿ en células PC3 están asociadas a la activación de la vía de señalización descendente FAK-SRC, tanto in vitro como in vivo. 3. Las alteraciones de las integrinas y sus vías descendentes por PGC1¿ dependen de su socio transcripcional ERR¿. 4. La regulación de MYC por PGC1¿ proporciona una explicación factible para el efecto inducido por el eje transcriptional PGC1¿/ERR¿. 5. El análisis de datos de alto rendimientos de pacientes con CaP y de líneas celulares in vitro identificó a CTHRC1 como la proteína secretada inversamente correlacionada con PGC1¿. 6. PGC1¿ reprime la expresión de ARNm de CTHRC1 en la línea celular de CaP PC3. 7. La expresión ectópica de CTHRC1 en células PC3 no rescata los cambios fenotípicos intrínsecos inducidos por PGC1¿. 8. El análisis in silico de genes relacionados con el secretoma y el matrisoma identificó a CTHRC1 como un candidato relevante para la progresión y el pronóstico del CaP. 9. La expresión de CTHRC1, tanto a nivel de ARNm como de proteína, está incrementada en el CaP y asociada con una mayor agresividad y un mal pronóstico. 10. En el tejido prostático normal y tumoral, CTHRC1 se expresa tanto en el estroma como en las células epiteliales. En el CaP, ambos compartimentos parecen ser responsables de aumento de la expresión de CTHRC1. 11. CTHRC1 está alterado tanto a nivel genómico como transcripcional. 12. La actividad del receptor de andrógenos emerge como un nuevo y potencial regulador de la expresión del ARNm de CTHRC1. 13. La reducción de la expresión de CTHRC1 afectan negativamente a la proliferación y al movimiento de células agresivas de CaP, pero no afectara sus capacidades invasivas. 14. Los mecanismos moleculares asociados a la reducción de CTHRC1 y por lo tanto a la inducción de un posible escenario supresor involucran principalmente a procesos biológicos tales como la vía del interferón, el sistema inmunológico y la interacción con la matriz extracelular.

Autofagia kontserbaturiko prozesu kataboliko bat da eta haren bidez degradatu egiten da kalteturiko edo beharrezkoa ez den material zelularra. Autofagiarekin erlazionaturiko (edo ATG) proteinek prozesuaren hainbat urrats erregulatzen dituzte eta 6 talde nagusitan banatzen dira. Horien artean ATG8 proteinen familia aurkitzen da, eta fagoforoaren elongazio prozesuarekin eta edukiaren hautaketa espezifikoarekin lotu da. Ugaztunetan, ATG8 proteina familia osatzen duten 6 homologoek egitura kontserbatua dute, ubikitina-muina eta N-muturrean kokaturiko 2 ¿-helizez osatua. ATG8 familia osatzen duten proteinen artean, LC3C da gutxien ikasi dena eta estrukturari dagokionez, LC3C familiako beste kideengandik bereizten da, batez ere bere N-muturrean, non lehen ¿-helizearen ordez, estrukturarik gabeko domeinu bat daukan. Azken urteetan egindako ikerketek nabarmendu dute LC3Ck ATG8 familiako beste kide batzuekin alderatuta, prozesu desberdinetan parte hartzen duela. Tesi honetan, LC3Cren eta mintzen arteko elkarreragina eta LC3Ck besikula fusionatzeko duen gaitasuna aztertu ziren. Gure emaitzek erakusten dute LC3C besikulen arteko fusioa eragiteko gai dela, eta fusio hori garrantzitsua dela aurofagosomaren tamaina erregulatzeko. Gainera, N-muturra identifikatu zen ezaugarri estruktural garrantzitsu gisa LC3Ck eragindako mintzen fusiorako.

El Glioblastoma es el tumor cerebral primario más frecuente y agresivo del Sistema Nervioso Central. Presenta un pronóstico muy pobre, con una mediana de supervivencia menor a los 15 meses, y los costes en la sociedad rondan los 200.000 euros por paciente. Desde la publicación del Protocolo STUPP en el año 2005 ningún Fármaco ha mejorado la escasa mediana de supervivencia que logra el fármaco alquilante Temozolomida (menor del 5% a los 5 años) La ausencia de nuevas moléculas/estrategias efectivas en el tratamiento del GBM desde entonces en la práctica clínica justifica la investigación y búsqueda de nuevos compuestos. Existen una serie de proteínas llamadas SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic) que actúan como transductores de los ligandos de la superfamilia de la vía TGFb (Transforming Growth Factor Beta), la cual tiene un papel crucial la regulación la transcripción de genes involucrados en la supervivencia, proliferación diferenciación y apoptosis celular en diferentes tejidos. Diferentes estudios teorizan que múltiples tejidos tumorales secretan unas moléculas anti-SMAD responsables en parte del aumento de la proliferación celular. Según nuestros estudios parece que una de estas proteínas, conocida como LEFTY parece estar sobre expresada en el Glioblastoma. Mediante un anticuerpo monoclonal ANTI-LEFTY hemos inhibido esta proteína y observado que se produce una disminución en la capacidad tumorogénica de las células de Glioblastoma al producirse un aumento de la senescencia y apoptosis; y una disminución de la proliferación y de la capacidad de autorrenovación celular. En resumen, hemos demostrado que la vía LEFTY-SMAD está alterada en el Glioblastoma y que su inhibición podría ser una estrategia terapéutica prometedora en el tratamiento de esta agresiva neoplasia del Sistema Nervioso Central.

La tesis se centró en analizar el papel de las proteínas G, en particular GIV, en la señalización celular y su relevancia en enfermedades, como el cáncer metastásico. Se investigó un posible fármaco, IGGi-11, que se une a G¿i3. Se emplearon técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) para estudiar la interacción de IGGi-11 con GDP-G¿i3, revelando detalles estructurales y afinidades. Se intentó cristalizar la proteína en complejo con IGGi-11 o GIV, logrando cristalizar la proteína libre, que se utilizó para acoplar el compuesto. Todos estos análisis determinaron que IGGi-11 es un inhibidor competitivo de la interacción G¿i3-GIV. Se realizaron también ensayos celulares en los que se observó que el tratamiento con IGGi-11 a células obtenidas de cáncer de mama (alta concentración de GIV) reducía la activación de las proteínas en la cascada de señalización mediada por la interacción G¿i3-GIV. Además, se investigaron otras interacciones con Gß1¿2, RGS12, R6A, R6A-1 y KB1753. Se observó que IGGi-11 podía unirse a los complejos GDP-G¿i3 en concentraciones elevadas, excepto en el caso de RGS12 y KB1753.

A pesar de décadas de investigación el VIH aún no ha podido ser erradicado. La existencia de anticuerpos ampliamente neutralizantes se presume una herramienta potente para conseguir una cura funcional o como modelos para una vacuna. En el presente trabajo de Tesis, se estudian los mecanismos de unión de algunos anticuerpos anti-MPER, siendo el propio MPER uno de los puntos de vulnerabilidad del VIH. Para ello, se recurre a la técnica de MP-SPR, que permite conocer con gran precisión algunos de las constantes cinéticas de la unión en un entorno de membrana, requisito necesario para una presentación del epítopo en un entorno semejante a la forma nativa. Además, se estudia cómo mutaciones del anticuerpo 10E8, el cual ya ha sido utilizado en ensayos clínicos, influyen en la manera de unión a su epítopo, así como la correlación entre estas mutaciones y su polirreactividad. En segundo lugar se estudia si la longitud de la membrana y/o una mayor longitud de la región transmembrana de MPER influye en el reconocimiento del anticuerpo 10E8 nativo. Finalmente, se comprueba si esta misma estrategia es aplicable a otros anticuerpos anti-MPER y la correlación con su potencia y polirreactividad.

El objetivo de mi tesis se centra en el desarrollo de técnicas in silico e in vitro para la predicción y caracterización de variantes causantes de hipercolesterolemia familiar e hiperlipemias. El uso de modelos y software para la predicción de patogenicidad de variantes facilita la identificación de variantes patogénicas. Estos modelos necesitan una base de datos robusta para poder ser desarrollados. Por esa razón, no se pueden aplicar a cualquier proteína. El receptor de lipoproteínas de baja densidad (en inglés, LDLR) ha sido ampliamente estudiado y cuenta con cientos de variantes caracterizadas, lo que nos ha permitido desarrollar dos modelos predictivos basados en distintas metodologías: MLb-LDLR y OptiMo-LDLR. En cambio, otros genes implicados en el desarrollo de hiperlipemias, como pueden ser PCSK9 o APOE, no cuentan con una base de datos tan amplia. En estos casos, la caracterización funcional de las variantes sigue siendo clave para la identificación de variantes patogénicas. Por esa razón, en esta tesis proponemos dos metodologías para la caracterización sistemática de variantes de PCSK9 y APOE.

En esta tesis introduzco una perspectiva holo-ómica para estudiar las interacciones huésped-microbiota en pollos de engorde de producción intensiva en relación con el rendimiento. Informo de los resultados de 3 ensayos experimentales idénticos que llevamos a cabo en 2019, en los que pollos de 2 líneas genéticas y de ambos sexos fueron criados bajo 3 tratamientos dietéticos, todos ellos estrechamente monitorizados a lo largo de su periodo de producción. La tesis engloba 3 artículos de investigación originales que resumen el trabajo colaborativo que he llevado a cabo con el resto de socios dentro del proyecto H2020 HoloFood. Identificamos una alta variación interindividual en el rendimiento del crecimiento de los pollos en los dos primeros ensayos, y una colonización oportunista de Campylobacter spp. ligada a un menor crecimiento de los pollos en el tercer ensayo. La tesis gira en torno a la hipótesis de que ambas tendencias de rendimiento pueden explicarse en parte por la interacción del hospedador y las comunidades microbianas intestinales asociadas. Nuestros hallazgos revelan que el microbioma intestinal transita de bacterias de alta capacidad funcional a bacterias de baja capacidad a medida que los pollos crecen, con una transición más pronunciada asociada positivamente al crecimiento de los pollos. Además, descubrimos que una propagación temprana de Bacteroides fragilis_A facilita la colonización por Campylobacter cambiando el perfil funcional de la comunidad microbiana con una actividad metabólica mayor y más especializada que impide que el hospedador gane peso. Esta tesis avanza colectivamente en nuestra comprensión de las interacciones huésped-microbiota en pollos de engorde, abriendo nuevas vías en la búsqueda de soluciones basadas en microbios para mejorar la producción animal de forma sostenible.

Townes-Brocks Syndrome (TBS) is a rare autosomal dominant genetic disorder linked to SALL1 gene mutations (SALL1MUT), affecting 1 in 250,000 live births. It manifests with distinctive features like dysplastic ears, preaxial polydactyly, imperforate anus, and heart/kidney anomalies. Most TBS-causing mutations result in de novo stop codons or frameshifts. TBS shares clinical traits with ciliopathies, showing cilia-related defects in patient-derived fibroblasts. LUZP1, identified through proximity proteomics as a SALL1MUT interactor, is an actin-associated protein and ciliogenesis suppressor. TBS cells exhibit reduced LUZP1 levels, degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS) likely due to SALL1MUT. We propose SALL1MUT interferes with LUZP1 proteostasis, impacting E3 ligase MIB1 and DUB enzyme USP21, both crucial for LUZP1 stability. MIB1, a RING-type E3 ligase, participates in LUZP1 ubiquitination, while USP21, a centrosome-localized DUB, contributes to LUZP1 deubiquitination and stability. The interplay between MIB1 and USP21 emerges as a pivotal factor in LUZP1 regulation.

El trabajo presentado en esta tesis se centra en el desarrollo de sondas de imágenes moleculares basadas en nanopartículas, diseñadas para su utilización en la Resonancia Magnética (MRI) y la Tomografía por Emisión de Positrones (PET), dos técnicas de imagen ampliamente utilizadas en la práctica clínica. Las nanopartículas exploradas en esta tesis se dividen en cuatro materiales distintos, que constituyen la base de los cuatro capítulos experimentales: i) Carbon Nanodots para su uso como agente de contraste; ii) Nanoparticulas basadas en Carbonato Cálcico y su uso como agente de contraste dirigido a la placa de aterosclerosis, iii) Nanopartículas de óxido de hierro diseñadas para la detección de tumores y evaluación de la dosis para su aplicación y finalmente, iv) Ferritas de Manganeso como agentes de contraste para resonancia magnética y uso como agente teranóstico en la enfermedad del cáncer.

El virus del Zika (ZIKV) es un arbovirus icosaédrico envuelto que pertenece a la familia Flaviviridae. La infección por ZIKV causa restricción del crecimiento intrauterino, aborto espontáneo y microcefalia en recién nacidos. A pesar de esta evidencia, se sabe poco sobre las rutas de transmisión de madre a feto y sobre el impacto que la infección por ZIKV tiene en los compartimentos celulares de las células placentarias en transformación. En un esfuerzo por abordar lo anteriormente mencionado, este proyecto se centró en utilizar diferentes técnicas de microscopía, como microscopia confocal, secciones ultrafinas embebidas en resina epon, crio tomografía de Rayos X Blandos (cryo-SXT), crio tomografía electrónica (cryo-ET), y la tomografía serial en bloque. Con el objetivo de detectar cambios ultraestructurales a las 24 y 48 horas post infección en células de trofoblasto inmortalizadas, así como en células primarias. En conjunto, todas estas técnicas de microscopía ayudan a comprender cómo progresa la infección por ZIKV en las células placentarias en transformación, proporcionando un escenario detallado de cómo están involucrados los orgánulos celulares y cómo se manipulan para producir progenie viral. Por último, pero no menos importante, esta estructura de flujo de trabajo de microscopía demuestra su importancia al empujar los límites de cómo podemos estudiar una infección viral celular en condiciones casi fisiológicas.

Esta tesis doctoral profundiza en el fenotipo de la hipertensión pulmonar (HP) mediante un modelo de ratón, explorando diferencias de género, consideraciones relacionadas con la edad y los diferentes efectos en el desarrollo de la enfermedad de dos regímenes dietéticos y el tratamiento de la 2-deoxiglucosa. Desafía nociones convencionales al resaltar disfunciones ventriculares específicas de género y revela características distintivas en ratones envejecidos con HP. Además, examina el impacto positivo de dietas cetogénicas y ricas en carbohidratos en el desarrollo de la HP. La evaluación de la 2-deoxiglucose como tratamiento destaca posibles efectos cardiotóxicos y diferencias de respuesta basadas en el género. En resumen, este estudio ofrece una visión integral de la HP, desafiando suposiciones y proporcionando conocimientos cruciales para mejorar estrategias diagnósticas y terapéuticas.

According to the World Health Organization (WHO), chronic inflammatory lung diseases, including asthma, COPD, fibrosis, or lung cancer are among the major causes of death Worldwide. Although these are subjects of intense investigation, progress on the therapeutic procedures to treat these diseases is not as fast as one might desire. Hence, novel therapeutic strategies are urgently needed to effectively treat lung cancer and inflammation. In the present thesis, we demonstrate that phosphatidic acid (PA), a bioactive glycerophospholipid, is implicated in the regulation of myoblast proliferation and lung cancer cell migration through mechanisms involving interaction of the phospholipid with LPA receptors and subsequent activation of key signaling pathways, namely the MAP kinases ERK1-2, p38 and JNK, as well as the JAK2/STAT3 and PI3K/Akt/mTOR pathways. In addition, we show that ceramide 1-phosphate (C1P) inhibits PA-stimulated lung cancer cell migration, and that it reduces cigarette smoke-induced human eosinophil migration. The latter aspects point to an antitumorigenic action of C1P in lung cancer and an anti-inflammatory effect of C1P in inflammatory diseases that accompany eosinophil accumulation, such as asthma or COPD. The results of this thesis suggest that therapies based on the use of C1P or C1P analogues may be useful for treatment of lung cancer and lung inflammatory diseases.

Schmallenberg Virus (SBV) is an arbovirus that belongs to the Peribunyaviridae family and Orthobunyavirus genus, being its closely counterparts Bunyamwera virus (BUNV) and Akabane Virus. SBV was discovered in late 2011 in Germany, it is transmitted by midges¿ bite and have been spreading on Europe, Asia and Africa ever since. The virus causes a disease associated with ruminants that includes fever, drop on milk production, diarrhoea and stillbirths, becoming a burden for small and large farms since its discovery. The SBV virion is pleomorphic and enveloped, enclosing its ribonucleoproteins, formed by the Nucleoprotein (SBV-N) in association with the segmented negative-sense RNA genome, beneath the lipid bilayer. The viral membrane is decorated by the GC and GN glycoproteins that together form the viral spike, the main mediators of viral infection. Among Orthobunyaviruses, the BUNV glycoprotein spike was already structurally described by cryoEM. On the other hand, structural data on SBV for its glycoprotein spikes and the whole virons and are currently very scarce. Concomitantly, due to the increasing spread of the arthropod vectors, there is a growing demand for alternative vaccines formulations against SBV. Hopefully, new prototypes will enter into the market in the future, complementing the current costly unattractive inactivated vaccines against SBV. The present work builds on previous studies from our findings on SBV-N as a promising vaccine candidate. We have investigated which regions from SBV-N are responsible for protection. Based on state-of-art immunological assays using mice models, we have identified both the N-terminal domain (N-term; Met1-Thr133) and a smaller fragment of it (C4; Met1-Ala58) as promising subunit vaccine prototypes. For the structural characterization of SBV, we have optimized purification protocols in order to obtain viral particles for different EM methodologies. This allowed preliminary analyses of the whole virion morphology and the glycoprotein spikes. Complementing vaccinology and structural studies, the present work proposes new immunogens against SBV infection at the same time that it enriches the current knowledge on the SBV morphology. Altogether, these findings are pivotal for a better understanding of the SBV pathology, finally allowing to tackle more efficiently this important veterinary pathogen in the inevitable outbreaks to come.

La presente tesis se centra en el estudio del contenido de las vesículas extracelulares y la manera en que interactúa con las células receptoras. La comunicación e interacción entre células es esencial en la progresión del cáncer de próstata. En nuestro laboratorio el interés en vesículas extracelulares como biomarcadores metabólicos comenzó en 2018 con un estudio sobre alteraciones metabólicas asociadas a vesículas presentes orina de pacientes de cáncer. El estudio describió que partes del metabolismo lípico y de hormonas esteroideas podían estar alterados. Por ello este trabajo comenzó desarrollando un ensayo de metabolómica para estudiar dichos cambios en una cohorte clínica. Este ensayo ha sido utilizado para el estudio de transferencia de activos metabólicos mediante vesículas extracelulares. También hemos estudiado si dicho transferencia confiere un fenotipo oncogénico a las células receptoras. Finalmente hemos estudiado la capacidad de las vesículas extracelular en procesos de progresión de la enfermedad como puede ser el desarrollo del estroma reactivo.

Desde el nacimiento del primer caso de FIV en 1978, la medicina reproductiva está experimentando un desarrollo rápido sin precedentes. Sin embargo, con el aumento mundial de la incidencia de infertilidad cada año, los médicos reproductivos enfrentan mayores desafíos. Cómo realizar un tratamiento preciso para los pacientes con infertilidad, optimizar el proceso y la eficiencia de la reproducción asistida y mejorar los resultados del embarazo se ha convertido en un problema importante en el campo de la reproducción. La bioinformática se ha utilizado ampliamente en la investigación de la salud reproductiva en varios niveles técnicos, incluyendo genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, para analizar las funciones normales de diferentes órganos en el sistema reproductivo o sus patologías anormales en diferentes niveles; también promueve el progreso del diagnóstico clínico y tratamiento de enfermedades relacionadas con la reproducción, promoviendo así el desarrollo e innovación de la investigación en salud reproductiva sobre la base de rigurosidad y cientificidad garantizadas.

This doctoral thesis explores the potential of protein-stabilised nanomaterials as safer and targeted alternatives for magnetic resonance imaging (MRI) contrast enhancement. In particular, consensus tetratricopeptide repeat (CTPR) proteins were explored as scaffolds for synthesizing and stabilising these nanomaterials. Leveraging the inherent modularity and customisable nature of CTPR proteins, the research aims to develop contrast agents with superior efficacy, biocompatibility, and specificity. CTPR proteins are engineered to incorporate various metal coordination sites, facilitating the stabilisation of diverse nanomaterials such as gadolinium oxide nanoclusters, iron oxide nanoclusters, and iron oxide nanoparticles, all serving as MRI contrast agents. Moreover, the protein scaffold is tailored to present therapeutic domains targeting specific molecular markers, enriching the contrast agents' functionality without compromising their MRI capabilities. This multifaceted approach holds promise for advancing MRI diagnostics through the development of tailored contrast agents with enhanced performance and safety profiles.

supramoleculares basados en el co-ensamblaje de péptidos y proteínas. El diseño racional de secuencias peptídicas y proteínas ha permitido el desarrollo de materiales híbridos coensamblados unidimensionales o bidimensionales. La dimensionalidad adoptada por el material depende directamente del diseño de la proteína. En primer lugar, se lleva a cabo un estudio de secuencias peptídicas para el desarrollo de fibras supramoleculares auto-ensambladas. En segundo lugar, se estudia la estabilidad y diseño racional de proteínas de repetición, modificándolas específicamente para el co-ensamblaje con las fibras supramoleculares. Finalmente, los materiales unidimensionales y bidimensionales son caracterizados y utilizados para distintas aplicaciones en bioelectrónica y cultivo celular. El trabajo incluye una simbiosis de métodos computacionales y experimentales las cuales facilitan el diseño racional de péptidos y proteínas, y la posterior caracterización de los materiales supramoleculares.