Defendatutako tesiak

This work focuses on the study of the neuropharmacological mechanisms underlying prostaglandin E2 (PGE2) receptor (EP) activation in locus coeruleus (LC) neurons and the preBötzinger complex (preBötC). PGE2 is an inflammatory mediator synthesized by the brain constitutive cyclooxygenase (COX) enzyme, whose activity is blocked by the nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). PGE2 binds to G protein-coupled EP1-4 receptors (EP1 to Gq, EP2 and EP4 to Gs, and EP3 to Gi/o). Activation of EP receptors by PGE2 has been shown to modulate synaptic transmission and neuronal activity in various brain regions. The noradrenergic nucleus LC, which is involved in the regulation of the sleep-wake cycle, arousal, cognition, pain, and reward behavior, expresses EP2, EP3, and EP4 receptors, but their functional role remains unexplored. Therefore, we aimed to characterize the EP2, EP3, and EP4 receptors pharmacologically in the rat LC by extracellular electrophysiological recordings in acute slices. On the other hand, the inspiratory pattern is generated by the preBötC, whose inspiratory neurons express ¿-opioid receptors (MOR) and respond to PGE2. Thus, administration of opioids produces respiratory depression while PGE2 increases the frequency of sighs and induces gasps under hypoxic circumstances. However, the possible interaction between both systems to cause major respiratory disturbances remains to be elucidated. For this purpose, we also examined the interaction between opioids and PGE2 in the mice preBötC by live time-lapse calcium imaging in organotypic slice cultures.

Schizophrenia is a multi multifaceted, heterogeneous, chronic and debilitating disorder triggered by a series of interacting genetic, developmental and environmental factors. Cognitive impairment is considered a core feature of this disorder and highly dependent on the correct functioning of the prefrontal cortex, however, current antipsychotics lack efficacy for treating this condition. Prenatal exposure to infection is contemplated as one the most significant environmental risk factors for developing schizophrenia in the offspring. In this context, maternal immune activation animal models produce neurochemical and behavioral alterations considered relevant for the study of schizophrenia dysfunctions. The first part of this thesis consists of a neurochemical and behavioral characterization of an animal model of cognitive impairment associated with schizophrenia by the administration of the immunostimulant agent Poly (I:C). The second part involves the study of the effects of ¿2-adrenoceptor compounds on cognitive performance in the offspring. Finally, selective targeting of the locus coeruleus-prefrontal cortex circuit by different optogenetic approaches was performed. The Poly (I:C) animal model shows a catecholaminergic hypofunction in the prefrontal cortex with marked cognitive deficits, which are reversed by the administration of ¿2A-adrenoceptor agonist guanfacine and the ¿2C-adrenoceptor antagonist MK-912. These results support the important role of the noradrenergic system in the prefrontal cortex-dependent cognitive functions and the Poly (I:C) animal model as a promising translational model of cognitive impairment associated with schizophrenia.

C. auris is a multidrug-resistant fungal pathogen that has recently emerged globally as a cause of life-threatening invasive infections. Despite the increasing concern on the reduced treatment options of C. auris infections, very few studies have investigated the in vitro time-kill activity of antifungal drugs against this species. Furthermore, PK/PD models, valuable tools to better characterise the activity of antimicrobial agents, are still lacking for this species. The overall aim of this Doctoral Thesis was to evaluate the in vitro activity of antifungal drugs belonging to the three main classes against C. auris, in monotherapy and in combinations, and to develop pharmacometric models for describing and predicting the activity of the drugs. In this work, Amphotericin B showed concentration-dependent fungicidal activity against C. auris in time-kill assays. Conversely, neither isavuconazole nor the echinocandins showed fungicidal or fungistatic against C. auris. The combination of amphotericin B with anidulafungin or caspofungin significantly enhanced the activity of the drugs compared to monotherapy. The interaction of isavuconazole and anidulafungin, caspofungin or micafungin was also deemed synergistic. The developed PK/PD models successfully characterised both monotherapy and isavuconazole plus echinocandin activity. Model-based simulations pointed out that amphotericin B susceptibility breakpoint for C. auris may be lower than the currently suggested one and that high dosing combination therapy of isavuconazole plus caspofungin or anidulafungin would be effective for the treatment of C. auris fungaemia.

Egun, ezaguna da Fosfolipasa C ß1 (PLCß1) hainbat zelulen desberdintze prozesuan inplikaturik dagoela, baita zelula neuronalen desberdintze prozesuan ere. Haatik, desberdintze neuronala bideratzeko PLCß1-aren ekintza mekanismoa aztertzen duten ikerketa gutxi burutu dira. Lan honetan, PLCß1-ak NTera2/D1 (NT2) zelulen ziklo zelularraren G1 fasea modulatu dezakela frogatu dugu eta modulazio hau, NT2 zelulen desberdintze neuronala bideratzeko mekanismoa izan daitekela proposatu dugu. Bestetik, PLCß1-ak zuzendutako NT2 zelulen desberdintze prozesuan sakondu dugu, bere bi splincing aldaerek eta zelula barneko kokapenak prozesu hau baldintzatu dezaketen aztertu baitugu. Azkenik, Saguen Helduaroko Hipokanpoko Ama Zelula Neuronalen desberdintzapen prozesuan PLCß1-ren mRNA eta proteina mailen igoera gertatzen dela frogatu dugu.

The physiological consequences of the super-specialization of the lipids in the different regions and cellular types of the central nervous system (CNS), remain largely being a mystery. In fact, the so-called neurolipids, which possess agonistic or neuromodulatory properties, play an essential role both in health and in pathological conditions. Thus, the lysophospholipid sphingosine 1-phosphate (S1P) system is one of these neurolipids involved in immune responses and cell survival functions. However, the S1P systems in CNS is not fully elucidated. Then, the present research study evaluates the S1P system in healthy brain and AD. In this sense, the anatomical distribution of functional coupling of G¿i/o proteins to S1P1 receptor in postmortem human brain samples and rodent models showed that S1P1 receptor could be one of the most abundant and/or efficient GPCR coupled to G¿i/o proteins in the brain and consequently signaling and regulating multiple biological processes. Moreover, the present results, indicate that is preferably the use of rat models to the study of S1P1 receptors activity in human neurodegenerative diseases, such as Alzheimer¿s disease. The S1P1 receptor activity during the AD progression in postmortem human brain samples indicated that the S1P1 receptor signaling was decreased in superficial layers of the frontal cortex during the initial stages. In contrast, the activities of both S1P1 and CB1 receptors, were increased at the initial stages of the disease in the internal layers of the frontal cortex that could be related to neuroprotection. Furthermore, the activity of the S1P1 receptor in the underlying cortical white matter was increased during the initial and intermediate stages of the disease. Finally, the activities of both, S1P1 and CB1 receptors, were reduced in the hippocampus at the most severe stages of the disease indicating the continuation of the brain impairment. Lipidomic evaluation of human plasma samples from mild cognitive impairment (MCI) and AD patients to identify biomarkers for early diagnosis. To sum up, the MCI patients showed a decrease in some lipid species such as TG in general, PC and PE containing linoleic acid, and some Cer. In contrast, the AD patients showed increase in some PE compared to MCI patients, but other lipid species, such as PC and SM, were decreased. Moreover, the changes in AD patients respect to control patients were mainly focused on Cer, SM and PC. The functionality of S1P1 receptors in the CNS of 3xTg-AD mice model of familial AD showed a decrease in some areas of the olfactory bulb, in the nucleus basalis magnocellularis, basolateral amygdaloid nucleus, fimbria and molecular layer of the hippocampal dentate gyrus, the substantia nigra and in the ventral tegmental area. All this changes could be related to the learning and memory impairment and the fear and anxiety behavior in this model. On the other hand, the activity of the S1P1 receptor in the CNS of sporadic AD by cholinergic basalocortical lesion showed an increase in the basolateral amygdaloid nucleus and the piriform cortex in layers I and II that could be related to the rearrangement at the projection areas. Conversely, a decrease was observed in the nucleus basalis magnocellularis and the corpus callosum associated to the apoptotic processes that follow the injury in this area. The analysis of the relationship between the S1P and cannabinoid systems indicated a possible crosstalk of both systems. S1P1 ¿selective¿ compounds have also certain affinity for CB1 receptors and the S1P1 activity is regulated after in vivo cannabinoid treatments, indicating a crosslink between S1P and eCB systems. The MALDI-IMS technique allows us to obtain extensive information for the field of lipidomics, demonstrating the relevance of the super-specialization of lipids in the different regions of the CNS. Moreover, the ¿Lipotype¿ of the different cells that are present in the brain, such as neurons, astrocytes, microglia, oligodendrocytes or ependymocytes, allows us to associate the functions performed by each of these cells with the lipids that compose them. Additionally, the implementation of new techniques of matrix deposition, allows to increase the power of this technique by obtaining the distribution of signaling molecules such as S1P or 2-AG, or even other molecules that otherwise could not be identified. In summary, the S1P system represents a promising target since is related to important physiological functions that in pathological situations may be disturbed, offering an opportunity to modify the progression of such pathologies that include the Alzheimer¿s disease.

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo, definido inicialmente por sus síntomas motores. Sin embargo, hoy en día la probabilidad de que se trate de un trastorno complejo en lugar de una enfermedad puramente motora es ampliamente aceptada. Una de las primeras áreas afectadas en esta enfermedad es el locus coeruleus (LC). Este núcleo proporciona extensa inervación noradrenérgica a todo el cerebro, incluida la corteza prefrontal, y desempeña un papel neuromodulador fundamental participando en la respuesta al estrés, memoria emocional y control de las funciones motoras, sensoriales y autonómicas. Dada la estrecha relación del sistema noradrenérgico con la enfermedad de Parkinson, y los trastornos ansiosos y de percepción dolorosa, el objetivo global de este estudio fue investigar el impacto de la degeneración dopaminérgica en la función de las neuronas del LC y sus posibles consecuencias comportamentales. En resumen, el presente estudio demuestra que el déficit dopaminérgico influye de manera significativa en el sistema noradrenérgico. La pérdida persistente de dopamina conduce a la hipoactividad y la hiperexcitabilidad del LC, junto a una comunicación disfuncional entre este núcleo y la corteza prefrontal. Estos cambios fueron estudiados mediante técnicas electrofisiológicos e histoquímicos in vivo y ex vivo. Además, el reemplazo dopaminérgico ha demostrado restaurar el patrón oscilatorio del LC y su actividad tónica y fásica. Este hallazgo confirma que los cambios observados en las ratas parkinsonianas se debieron directamente a la pérdida dopaminérgica y enfatiza la implicación del sistema dopaminérgico en la modulación del LC. Sin embargo, las modificaciones observadas en el LC tienen un impacto discreto en el comportamiento nociceptivo y ansioso.

Egun, ezaguna da terminal sinaptiko glutamatergiko eta GABAergikoetan espresatzen den CB1 hartzailearen aktibazioak aktibitate neuronal eszitatzaile-inhibitzailearen balantzea erregulatzen duela. Horregatik, bi terminal mota hauetan aurkitzen den CB1 hartzailearen seinaleztapen kanonikoaren (G¿i/o proteinen akoplamentua) azterketa zehatza beharrezkoa da agonista kannabinoideen efektuak garunean zehar karakterizatzeko. Lan honetan, CB1 hartzailea neurona glutamatergiko edo GABAergikoetan espresatzen duen sagu transgenikoak erabiliz, kortex frontaleko eta hipokanpoko bi terminal sinaptiko hauetan CB1 hartzailearen seinaleztapen kanonikoa hartzailearen espresio mailarekin positiboki erlazionatzen dela frogatu dugu. Gainera, kolesterola CB1 hartzailearen funtzio kanonikoa negatiboki modulatzen duen konposatu alosteriko gisa identifikatu dugu.

La enfermad de Párkinson es un trastorno neurodegenerativo en el que varios sistemas de neurotransmisión se ven afectados. En los últimos años, numerosas evidencias clínicas y experimentales han demostrado el papel del sistema serotonérgico en el desarrollo y en los síntomas de esta enfermedad así como en las complicaciones motoras derivadas del tratamiento crónico con levodopa, conocidas como discinesias inducidas por levodopa. El objetivo de esta tesis ha sido caracterizar el efecto de la buspirona, un agonista parcial de los receptores serotoninérgicos 5-HT1A, en los principales núcleos de salida de los ganglios basales, la substantia nigra pars reticulata (SNr) y el núcleo entopeduncular (EP) mediante técnicas electrofisiológicas in vivo, un estudio histoquímico para la actividad del citocromo c oxidasa (COX) y estudios inmunohistoquímicos para el receptor 5-HT1A y el transportador de la serotonina (SERT), que fueron realizados en los ganglios basales y el núcleo dorsal del rafe. En este trabajo se ha demostrado que el efecto de la buspirona y el agonista total 5-HT1A, 8-OH-DPAT, sobre la actividad de la SNr y el EP se ve comprometido tras el déficit dopaminérgico, y está prácticamente ausente en la actividad oscilatoria entre estos núcleos y la corteza motora. Sin embargo, estos fármacos pueden normalizar la descarga en ¿burst¿ durante el parkinsonismo. Además, se ha observado un aumento generalizado de la actividad de la COX junto con cambios en la expresión del receptor 5-HT1A y del SERT en las ratas parkinsonianas tratadas o sin tratar con levodopa. Estos resultados sugieren que la actividad ¿burst¿ en modelos experimentales es importante para estudiar el efecto terapéutico de nuevos fármacos antiparkinsonianos y antidiscinéticos.

Schizophrenia is a chronic and disabling mental illness that affects around 20 million people worldwide. The etiology of the disorder is multifactorial, and different genetic and environmental factors take part in its onset and course. However, the mechanisms underlying this interaction remain poorly understood. Cannabis abuse, especially during adolescence, has been associated with an increased risk of developing schizophrenia as well as with an earlier onset. The main aim of this Thesis consisted in evaluating the molecular mechanisms underlying this relationship, with a focus in two targets previously related with schizophrenia: serotonin 2A receptors (5-HT2AR) and Akt/mTOR signaling pathway. For this purpose, we evaluated (1) the G¿ protein subunits activation exerted by three cannabinoids, including THC in mouse brain cortex, (2) chronic THC effects on psychosis-like states, cortical 5-HT2AR functionality and Akt/mTOR signaling pathway status, (3) the implication of Akt/mTOR signaling pathway in these effects, (4) the Akt/mTOR signaling pathway status in postmortem prefrontal cortex (PFC) of subjects with schizophrenia, and (5) the 5-HT2AR protein expression and Akt functional status in platelets from subjects with a cannabis use disorder, with and without schizophrenia. Most significant results from this Thesis show that chronic THC leads to hyperactive 5-HT2AR functionality in the brain cortex associated with a hyperactive Akt/mTOR signaling and psychosis-like behavior. Disruption of this signaling pathway is also evident in postmortem PFC and platelets of subjects with schizophrenia, and cannabis abuse seems to exert different effects depending on the presence of schizophrenia pathology. Together, this Doctoral Thesis suggests that 5-HT2AR and Akt/mTOR pathway are elements of an interacting mechanism involving chronic cannabis pharmacological effects and schizophrenia pathogenesis.

El punto de partida para la realización de este trabajo ha sido la falta de estudios que permitan conocer las consecuencias de la falta de adherencia a la prescripción de la dosificación antimicrobiana sobre su eficacia en el tratamiento de neumonía adquirida en la comunidad en los pacientes ambulatorios. Ante la imposibilidad ética de plantear estudios clínicos controlados para evaluar este objetivo, el objetivo de nuestro trabajo ha sido evaluar las consecuencias de la falta de adherencia al tratamiento antimicrobiano empírico con Amoxicilina, Levofloxacino y Moxifloxacino, en pacientes con neumonía adquirida en la comunidad en tratamiento ambulatorio, sobre su eficacia clínica antimicrobiana, medida como probabilidad de alcanzar un determinado índice Fc-Fd basado en el análisis de sus propiedades farmacocinéticas-farmacodinámicas y teniendo en cuenta la variabilidad interindividual de los pacientes. Se han realizado estudios de simulación farmacocinética-farmacodinámica, como herramienta metodológica de trabajo, en diferentes escenarios de pacientes virtuales. Una de las consecuencia es que en zonas geográficas con baja incidencia de resistencia a S.Pneumoniae, la Amoxicilina, s, presenta clara ¿idoneidad¿ en estas poblaciones, , aun en situación de presentar baja adherencia al tratamiento.

The CB1 and CB2 receptors are the main GPCRs of the endocannabinoid system, and regulate many important physiological processed as pain, inflammation, or behaviour. Increasing interest exist to develop new drugs targeting these receptors, as they constitute potential drug targets for many diseases as Alzheimer disease, Huntington disease, chronic pain, or inflammation. During the last decades, the interest around the binding kinetics of drugs has hugely expanded, as it has been shown to be an important determinant of in vivo drug action in many cases. Moreover, studying the kinetic interactions of drug binding to its target can also provide valuable information in order to understand the efficacy at a molecular level. In this work, we generated a novel fluorescence-based assay that allows the determination of binding association and dissociation rates of cannabinoid compounds at CB1 and CB2 receptors. Using the methodology proposed by Motulsky and Mahan, we successfully determined the kinetic parameters of seven different cannabinoid compounds at both CB1 and CB2 receptors. We also studied the efficacy of the selected cannabinoid compounds using three different assays. On one hand, we determined the coupling to miniGsi and b-arrestin 2 using BRET biosensors. On the other hand, we successfully determine the internalization that cannabinoid compounds elicited using a technique based on diffusion-enhanced resonance energy transfer (DERET). Applying the operational model of agonism (OMA) proposed by Black and Leff, the bias exerted by the compounds at both CB1 and CB2 receptors was determined for the studied responses. Finally, we explore the relationship between the efficacy elicited at the different responses with the residence time of the cannabinoid agonists.

The basal ganglia (BG) are a network of subcortical nuclei that classically have been considered to be involved in motor behaviours, with mounting evidence in the last decades indicating that they are also involved in cognitive and emotional processing. The BG nuclei are involved in several pathologies such as Parkinson¿s disease, where the dopaminergic (DA) system, that influences BG function, is seriously affected. The endocannabinoid system, especially the CB1 receptor, is highly expressed in the BG representing a promising therapeutic target in disorders related with these structures. The objective of this thesis was to characterize the CB1 receptor modulation on the sensorimotor and medial prefrontal BG circuits, as well as the impact of DA denervation upon them, using electrophysiological techniques. In this work, cortical information cross through both BG circuits differently, in a way that was affected by DA denervation. Moreover, the CB1 receptor is able to modulate information transmission through both BG circuits differently. Further assessment on the role of the role of the CB1 receptor on these circuits revealed that it specially influences cortico-striatal transmission through the SM circuits. After DA denervation, the ability of the CB1 receptor to modulate transmission was generally lost in both circuits, although there were no changes in the density of this receptor in the BG nuclei. This data contribute to increase our understanding of BG function, and the role of the endocannabinoid system in modulating BG circuits, in physiological and hypodopaminergic states. Hence, providing further evidence on the potential of the endocannabinoid system as a pharmacological target in pathologies with BG dysfunction such as Parkinson¿s disease.

Los ganglios de la base son un conjunto de núcleos conectados entre sí que conforman un circuito neuronal encargado de controlar el movimiento voluntario. La substantia nigra pars reticulata (SNr) forma parte de este circuito y además posee un lugar privilegiado dentro de esta red siendo así la estructura que integra toda la información y permite la selección y la ejecución de tareas motoras. En la enfermedad de Parkinson (EP), esta función integradora y de selección de acciones se ve perjudicada, lo que conduce a la aparición de los síntomas motores de la EP. Estudios recientes han identificado varios tipos de neuronas dentro de la SNr, cuyas funciones en el control motor son actualmente desconocidas. El objetivo de mi doctorado consistió en caracterizar estos tipos de neuronas con el objetivo de desarrollar estrategias terapéuticas más selectivas para así restaurar la función motora en modelos de roedores con EP. Para ello combinamos técnicas inmunohistoquímicas y electrofisiológicas en una línea de ratones que nos permitía diferenciar entre dos tipos de neuronas y observar qué subpoblación era más susceptible a la EP y al consiguiente tratamiento con L-DOPA (tratamiento por excelencia en EP). El conocimiento generado por este proyecto de investigación básica permitirá el desarrollo de enfoques terapéuticos para reducir los síntomas motores en los pacientes con EP.

La esquizofrenia (SZ) es una enfermedad mental crónica e incapacitante. Su etiología es de carácter multifactorial teniendo un componente genético y otro ambiental que intervienen en su aparición y el curso de la enfermedad. Los primeros síntomas que aparecen son los cognitivos y no tienen tratamiento. La hipótesis principal de esta Tesis Doctoral se basa en que los receptores adrenérgicos ¿2A (¿2A-AR) de la corteza prefrontal (CPF) son hipofuncionantes y pueden estar relacionados con los déficits cognitivos de la patología. Para ello se ha estudiado en la CPF de humanos postmortem (1) la expresión proteica de los ¿2A-AR y ¿2C-AR en el sinaptosoma, la fracción presináptica y postsináptica, (2) la funcionalidad de los ¿2-AR, (3) la expresión génica de los genes ADRA2A y ADRA2C, (4) modificaciones epigenéticas en los promotores de los genes ADRA2A y ADRA2C y (5) evaluar la expresión proteica de espinofilina, como marca de espinas dendríticas, en el sinaptosoma, la fracción presináptica y postsináptica. Todo ello se ha realizado comparando cerebros de sujetos controles y sujetos con esquizofrenia, evaluando la influencia de los fármacos antipsicóticos (AP) en todo ello. Los resultados más destacables de esta Tesis Doctoral son (1) el aumento de la expresión proteica de los ¿2A-AR en la fracción postsináptica en sujetos con SZ y AP, (2) una hipofunción de los ¿2-AR sujetos con SZ y AP, (3) una disminución de la expresión génica del ADRA2A sujetos con SZ y AP y de ADRA2C en SZ, (4) alteración en modificaciones epigenéticas en los dos promotores en SZ y (5) una disminución en la expresión proteica de espinofilina en la fracción postsináptica en sujetos con SZ y AP. Estos resultados sugieren que los AP pueden alterar la funcionalidad y expresión de los ¿2-AR y la expresión de dendritas sinápticas en la CPF de sujetos con SZ.

The selective vulnerability of the basal forebrain cholinergic system (BFCS) is responsible for most of the clinical alterations in learning and memory processes that are characteristic of the Alzheimer¿s disease (AD). The loss of cholinergic neurons and muscarinic receptors (MR) in the nucleus basalis of Meynert has been reported in AD. The endocannabinoid system is a neuromodulator of the BFCS, but there are controversial reports regarding the cannabinoid effects in learning and memory processes. The animal models of cholinergic impairment mimick the main histopathological and behavioral effects observed in patients. The MR antagonism, e.g. using scopolamine (SCOP), is used as a model of amnesia in rodents. The intraparenchymal administration of 192-IgG-saporin (SAP) in the nucleus basalis magnocellularis eliminates cholinergic neurons leading to learning and memory deficits. Then, the present study evaluates the modulation of spatial and working memory with the Barnes Maze following a subchronic treatment with a low dose (0.5 mg/kg) of WIN55,212-2 (WIN) in both the SCOP and SAP models of learning and memory deficit. In the SCOP model, the administration of WIN protects learning and memory impairment during the probe trial, recorded as the time spent in the target quadrant (WIN + SCOP: 78 ± 13 sec vs VEH + SCOP: 45 ± 3 sec; p ¿ 0.001). A similar effect of the treatment was observed in the SAP model (SAP: 50 ± 3 sec vs SAP + WIN: 82 ± 7 sec; p ¿ 0.001). This effect was specifically mediated by CB1 receptors, since it was blocked by the co-administration of the specific CB1 antagonist, SR141716A (0.5 mg/kg) (SAP: 49 ± 3 sec vs SAP + WIN + SR: 48 ± 5 sec). However, higher doses of WIN (3 mg/kg) induced negative effects in learning and memory in control (C) rats, but positive and comparable to the lower dose in the SAP model (C: 89 ± 3 sec, C + WIN-3 mg/kg: 48 ± 3 sec; SAP: 49 ± 3; SAP + WIN-3 mg/kg: 80 ± 12 sec). The CB1 activation by low doses of the cannabinoid agonist WIN are able to block the amnesic effects induced by SCOP and also the learning and memory impairment produced by the BFCS pathway degeneration. CB1 agonists could contribute to improve the clinical symptoms of AD.

La esquizofrenia es una enfermedad prototípica humana de etiología aún desconocida. La investigación con modelos animales permite estudiar las causas y mecanismos afectados en dicha enfermedad. Así, fármacos como el DOI, actuando como agonista del receptor de serotonina 5-HT2A, induce sintomatología similar a la esquizofrenia de tipo paranoide. Existe un heterocomplejo formado entre los receptores 5-HT2A/mGlu2 en la corteza prefrontal de cerebros humanos y roedores, necesario para desencadenar dicha sintomatología positiva de esquizofrenia. Un número sustancial de artículos habían demostrado la interacción entre ambos receptores, incluyendo estudios celulares, genéticos, biofísicos y bioquímicos in vitro, pero la funcionalidad de este complejo in vivo permanecía aún poco conocida. La presente Tesis Doctoral evalúa la funcionalidad de este heterocomplejo in vivo, mediante el estudio de la liberación de catecolaminas en la corteza frontal de roedor tras la administración del alucinógeno DOI. Asimismo, se ha realizado un estudio de algunos circuitos noradrenérgicos modulados por la administración de este alucinógeno y se ha estudiado brevemente la señalización celular desencadenada por la activación del receptor 5-HT2A.

La retinosis pigmentaria (RP) es la principal causa genética de degeneración de la visión en todo el mundo con más de 1.5 millones de afectados, para la que aún no existe un tratamiento estandarizado y eficaz. Esta enfermedad se caracteriza por su gran heterogeneidad clínica y genética, con más de 70 genes relacionados en su desarrollo. Partimos de la hipótesis de que en la RP se ve alterado un conjunto de mecanismos moleculares comunes a distintas formas de la enfermedad, con independencia del gen mutado. Esta idea se apoya en distintos trabajos en los que se ha descrito un patrón común de expresión diferencial tanto de genes, como de microRNAs en distintos modelos animales de RP, causados por mutaciones en genes diferentes. El desarrollo de esta tesis se ha planteado alrededor de dos objetivos principales; por una parte el estudio de la expresión de microRNAs para la identificación de microRNAs diferencialmente expresados que sirvan como potencial diana terapéutica en la RP, y por otra parte la modulación in vivo de un grupo de microRNAs y el análisis del efecto de dicha modulación en un modelo animal de la enfermedad, el ratón rd10.

La esquizofrenia es una enfermedad mental crónica e incapacitante de etiología aún desconocida. El receptor 2A de serotonina (5-HT2AR) es a la vez diana de compuestos alucinógenos y de antipsicóticos atípicos. Los estudios de funcionalidad del receptor en tejido cerebral humano post-mortem de sujetos con esquizofrenia sugieren una hiperactividad del 5-HT2AR. En este contexto se ha demostrado la existencia de una mayor activación de la proteína G¿i1 por el agonista del 5-HT2AR (±)DOI en cerebro humano post-mortem de sujetos con esquizofrenia, sin alteraciones en la vía canónica, es decir la hiperactividad muestra selectividad funcional. La presente tesis doctoral evalúa el hecho de si esta mayor activación se debe a una alteración en la actividad constitutiva del 5-HT2AR sobre la vía alucinógena dependiente de la vía G¿i1, que está aún por demostrar, y para hacerlo es necesario el uso de agonistas inversos. Entre ellos, pimavanerina y altaserina se comportaron como agonistas inversos de la vía G¿i1 pero comoantagonistas neutros sobre la vía canónica G¿q11. En cambio, volinanserina actúa como agonista inverso también sobre la vía G¿q11. Por ello, pimavanserina y volinanserina se utilizaron como herramientas farmacológicas para estudiar la existencia de una mayor actividad constitutiva en cerebro humano post-mortem de sujetos con esquizofrenia. Estos estudios confirmaron la existencia de una mayor actividad constitutiva del 5-HT2AR en sujetos con esquizofrenia frente a sujetos control, mediada selectivamente por la vía pro-alucinógena G¿i1, mientras que no se observan cambios en la vía canónica G¿q/11 del 5-HT2AR. Además, fármacos antipsicóticos atípicos como clozapina y risperidona presentaron un perfil selectivo como agonistas inversos de la vía G¿i1 del 5-HT2AR. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que nuevos fármacos que actúen selectivamente como agonistas inversos del 5-HT2AR sobre la vía pro-alucinógena, podrán presentar una mayor eficacia.

El uso de analgésicos opioides en el tratamiento del dolor está limitado por la aparición de efectos adversos como la tolerancia. Los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), que reducen el dolor y la inflamación mediante la inhibición de la síntesis de prostaglandinas, mejoran los efectos de los opioides, aunque también causan importantes efectos adversos. En este sentido, la modulación selectiva de los receptores EP prostanoides podría constituir una estrategia para mejorar la eficacia de los opioides. Por lo tanto, el objetivo de la tesis fue caracterizar la implicación del sistema prostanoide en los efectos agudos y crónicos de los opioides. Para ello, se realizaron estudios electrofisiológicos uni-extracelulares en rodajas cerebrales de rata que contenían el locus coeruleus (LC), principal núcleo noradrenérgico del cerebro que expresa tanto receptores ¿ opioides (MOR) como receptores EP prostanoides. Los resultados sugieren que la activación del receptor EP4, pero no del EP2, podría potenciar el efecto inhibitorio de los opioides sobre la actividad neuronal del LC, así como la desensibilización del MOR. Además, en ratas sometidas a inflamación periférica, el efecto del agonista opioide Met-encefalina está reducido en el LC contralateral a la inflamación. Finalmente, el tratamiento subcrónico con morfina potencia el efecto estimulatorio mediado por el receptor EP4 sobre la actividad neuronal del LC; sin embargo, la administración in vivo de un antagonista EP4 no previene la tolerancia celular inducida por morfina.

Los déficits cognitivos de la esquizofrenia son un síntoma central, son indicadores del pronóstico de la enfermedad y son resistentes a los tratamientos actuales. Se sospecha que los antipsicóticos atípicos podrían empeorar los déficits cognitivos, y se ha propuesto que este proceso tiene lugar a través de una regulación epigenética de las histonas deacetilasas y que podría ser inducido por un exceso de actividad neuroinflamatoria. En la etiopatogenia de esquizofrenia se ha sugerido la existencia de eventos prenatales que generan vulnerabilidad y que posteriormente se reactivan por procesos estresantes durante la adolescencia, constituyendo un fenómeno de "doble-hit". Se considera que la fisio- y psicopatología de la enfermedad podría vincularse a ese fenómeno a través de un exceso de actividad neuroinflamatoria. Teniendo en cuenta todo lo anterior, la presente Tesis Doctoral se centra en la validación de un modelo animal ¿doble-hit¿ de esquizofrenia en ratones macho y hembra. El modelo doble-hit está basado en la activación inmune materna durante la gestación -mediante la administración de un análogo de ARN viral, denominado Poly (I:C)- seguido de un periodo de aislamiento social durante la pubertad. El modelo doble-hit ha demostrado poseer alteraciones comportamentales asociadas con esquizofrenia, así como alteraciones inflamatorias y epigenéticas relacionadas. con la enfermedad. Asimismo, se ha evaluado el efecto de un tratamiento crónico con antipsicóticos atípicos y fármacos anti-inflamatorios. Los hallazgos obtenidos en este trabajo demuestran que el modelo doble-hit es una herramienta válida para el estudio de la esquizofrenia.

This research project was designed to acquire a deeper knowledge on how physiological changes during aging may affect the pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD). Elderly adults are a vulnerable population due to the physiological changes associated with age and the additional problems of polypharmacy and comorbidity diseases. Therefore, a better understanding of the clinical pharmacology of old age is important in the development of pharmacometric strategies that could support dose selection in this special population. In order to establish if the use of predictive PK/PD models that include changes in the ADME processes as a function of age, already applied to pediatrics, will also be also predictive in the geriatric population, the antihistamine drug bilastine was employed as a probe drug. On the one hand due to the wide knowledge of the research team on this drug, and on the other hand as a PK/PD data package was available in geriatric patients to inform the model building and to validate the predictions. As a first step in this research project, a database was created using data from the public domain used to develop the equations that relate ADME processes with physiological metrics as a function of aging. These equations were then used to develop the Senescence model. The mechanistic approach proposed in this research project integrated the available drug PK knowledge in adults as well as the impact of the physiological changes in elderly affecting the PK and/or PD of bilastine followed by the application of modelling and simulation techniques. The underlying mechanisms affecting the PK of bilastine were elucidated by combining a compartmental model structure together with principles of physiology related to distribution and elimination processes in order to determine the impact of key physiological parameters that were predictive of PK behavior of bilastine in adults and also in the geriatric population. Moreover, considering that the proposed predictive model was built on a physiological basis, it was used to predict PK in elderly patients with renal impairment with the aim of exploring the impact of this pathophysiological condition on bilastine PK. Overall, in both scenarios, the model¿s predictive performance was satisfactory evaluated using available geriatric PK data indicating that the main assumptions concerning the agedependent processes determining the pharmacokinetics of bilastine, are overall well described.

Los datos recogidos en la presente Tesis Doctoral aportan conocimientos nuevos y originales sobre el patrón de expresión de la proteína matricelular hevina en el cerebro humano y su implicación en la fisiopatología del trastorno por abuso de alcohol (o AUD por sus siglas en inglés). En primer lugar, se realizó una profunda caracterización de la expresión de la proteína hevina utilizando diferentes tejidos humanos, mediante la cual se detectaron dos formas glicosiladas de la proteína en cerebro humano. Se midió y comparó la expresión de ambas formas en cuatro áreas cerebrales de muestras humanas postmortem (córtex prefrontal, hipocampo, núcleo caudado y cerebelo) y en sus respectivas preparaciones subcelulares (homogeneizado total, citosol y fracción enriquecida en membranas neuronales). También se cuantificó y se comparó la expresión de la hevina entre los tumores cerebrales de astrocitoma y meningioma. Además, se descubrió que la hevina se expresa en el líquido cefalorraquídeo y el plasma humanos, pero está ausente en las células sanguínea. En segundo lugar, se compararon los niveles de expresión del ARNm y de la proteína hevina entre los sujetos con AUD y los controles, utilizando muestras de cerebro humano postmortem de las áreas mencionadas anteriormente; que mostraron de manera general una sobreexpresión de la hevina en las regiones estudias. En tercer lugar, se administró a ratones adultos cuatro regímenes diferentes de etanol y se detectaron alteraciones de la expresión de la hevina tanto en el plasma como en el cerebro de estos ratones, esta última sugiriendo que el etanol afecta a la expresión cerebral de la hevina, de manera diferente según la zona del cerebro y el tratamiento. Por último, se manipulo la expresión de la hevina para producir una disminución de la misma en los astrocitos del núcleo accumbens de los ratones y se observó que ello producía una alteración en el consumo de etanol, lo que sugiere una implicación de la hevina en el sistema de la recompensa.

Basal ganglia (BG) circuits are involved in different functions from movement control to cognitive/motivational processes. The loss of dopamine (DA) in these circuits triggers Parkinson¿s disease (PD). In addition to DA depletion, PD patients present an early serotonergic (5-HT) alteration at the level of the BG nuclei. 5-HT modulates the activity of BG circuitry by acting on a large variety of 5-HT receptor subtypes. Among them, the 5-HT2A receptor is expressed in both motor and associative/limbic territories of the BG nuclei being implicated in regulation of motor, executive and cognitive functions, as well as automatisms. In addition, 5-HT2A receptors may also play a role in diseases linked to BG dysfunction, such as PD. Firstly, we investigated the specific contribution of 5-HT2A receptors on the dynamic regulation of BG circuits. For that purpose, in vivo single-unit extracellular recordings of lateral and medial substantia nigra pars reticulata (SNr) neurons along with simultaneous electrical stimulation of the motor and mPF cortex were used. The results showed a topographical-dependent dissociation in the effects triggered by the 5-HT2A agonist TCB-2, which specifically increased the medial SNr neuron activity and had preferential action on mPF cortical information processing through the striato-nigral direct pathway. These findings provide novel evidence about the specific signature of 5-HT2A receptors on the dynamic regulation of BG circuits. Secondly, we focused on the study of BG dynamics in pathological conditions. In PD, dopaminergic therapy such as the administration of the precursor levodopa reduces the symptomatology and improves movement execution in the early stage of the disease, but quickly triggers abnormal and involuntary movements known as levodopa-induced dyskinesia (LID). LID is very debilitating and refractory to any further drug treatment. Hence, understanding the neuronal mechanism underlying LID is fundamental to develop new therapeutic strategies. Recent studies have shown that LID is caused by excessive neuronal activity in the striatum, however, how such striatal activity impacts BG downstream circuits such as the external globus pallidus (GPe) to generate LID is still unknown. In addition, a subpopulation of GPe neurons called the arkypallidal (Arky-GPe) neurons, directly form a negative feedback loop with the striatum to powerfully control action inhibition in normal conditions. We used optical methods to monitor in vivo the calcium activity of Arky-GPe neurons across different motor and disease states. Having characterised the abnormal changes of activity, we then used optogenetic manipulation to test their causal contribution to LID generation. We found that optogenetic reactivation of Arky-GPe neurons during LID reduces hyperkinetic behaviour and promotes normal-like motor behaviour. These results pave the way to understand the complex mechanisms involved in the generation and maintenance of LID.

The endocannabinoid system (eCB) plays a crucial role in various physiological processes including fear responses, learning and memory. This system comprises cannabinoid receptors, endogenous ligands and enzymes, and its many roles make it an interesting target for therapeutic interventions. This Doctoral Thesis delves into the modulation of fear expression, memory processes and neuroinflammation by CB1 receptors, highlighting their therapeutic potential. This work encompasses diverse models, such as fear expression and extinction paradigms based on the passive avoidance test, models of cognitive impairment derived from cholinergic dysfunction, mouse models of familial Alzheimer's disease, a mouse model of a neurodevelopmental disorder, Williams-Beuren syndrome, and mice lacking a specific kinase, PKC¿, greatly involved in cognition. The investigation reveals alterations in CB1 receptors across different brain areas in these models and evaluates the effect of subchronic cannabinoid treatments in some of them. Furthermore, underscoring the importance of developing more specific drugs targeting the eCB system, newly synthesized molecules are screened for affinity for cannabinoid receptors. Finally, the thesis studies the impact of lipids, especially polyunsaturated fatty acids, on CB1 receptor ligand binding. These findings have the potential to change the current understanding of pharmacology, paving the way for the development of more effective and targeted therapeutic interventions.

La depresión es una de las enfermedades más discapacitantes en todo el mundo. Aunque se desconocen con exactitud los mecanismos patogénicos de esta enfermedad, los estudios realizados indican que puede desencadenarse, en parte, por un metabolismo energético y perfil lipídico anormal. La ketamina, es un antidepresivo de acción rápida y mantenida, eficaz en pacientes con depresión resistente a otros tratamientos. Mediante estudios enzimáticos en microarrys, observamos que, por un lado, la ketamina aumenta la actividad de los complejos II y IV en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), y también, la actividad del complejo IV mitocondrial en plaquetas de pacientes con esta patología. En este sentido, la actividad del complejo IV correlacionó negativamente con las puntuaciones obtenidas en la escala BDI II antes del tratamiento y después de la octava administración de ketamina en plaquetas de pacientes con DRT. Por otro lado, mediante espectrometría de masas se observó que la ketamina produjo un cambio en ciertos lípidos, que a su vez correlacionaron las puntuaciones de la escala MADRS. Por último, se identificaron dos nuevos biomarcadores lipídicos como variables predictoras de la escala MADRS tanto para la clasificación de pacientes como para la monitorización del grado de eficacia del tratamiento con ketamina en pacientes con DRT.

Los dos estudios de esta Tesis Doctoral tienen como objetivo entender las bases moleculares de la esquizofrenia. El primero utiliza células del neuroepitelio olfatorio de sujetos con esquizofrenia y controles emparejados en edad y sexo. Estos cultivos son valiosos para buscar biomarcadores útiles en predicción, diagnóstico o pronóstico. Por otro lado, el segundo estudio se enfoca en establecer y caracterizar un modelo animal de esquizofrenia mediante la activación inmune materna y la exposición crónica al THC durante la adolescencia. Ambos estudios buscan mejorar la comprensión de la enfermedad para desarrollar tratamientos más efectivos. Como conclusiones de la Tesis Doctoral, se destaca que el epitelio olfatorio es una fuente confiable para aislar neuroesferas, células neuronales y gliales, y que el modelo animal refleja síntomas similares a los observados en pacientes con esquizofrenia. También se observan alteraciones a nivel transcriptómico y en la vía AKT/mTOR/S6 entre sujetos con esquizofrenia y controles, así como entre el grupo animal de doble hit (infección inmune materna + administración crónica de THC) y sus respectivos controles.