Antropogenética - Actividad 7

Diseño de una reacción PCR

Pretendemos identificar un minisatélite mediante PCR y gel de poliacrilamida.

Para ello hemos buscado unos cebadores adecuados, que tienen las siguientes características:

Forward primer
Sequence (5'->3') GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG
Temperatura de anillamiento: 67

Reverse primer
Sequence (5'->3') GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC
Temperatura de anillamiento: 65

Conocemos por la bibliografía un protocolo de amplificación, pero algunos de nuestros reactivos parecen tener un grado de calidad diferente de los que se utilizaron en el trabajo original y hemos de adaptar ligeramente algunas concentraciones del mix PCR y algunas temperaturas del programa del termociclador.

Hasta ahora hemos realizado varias amplificaciones, con las condiciones y resultados que se muestran a continuación. ¿Cuáles deberían ser las condiciones para una correcta amplificación?
Nota: Las condiciones son ficticias y diseñadas específicamente para el ejercicio

Mix PCR:
Volumen
Buffer
1 µl
MgCl2
0,4 µl
dNTPs
0,2 µl
Glicerol
0,5 µl
Cebador 1
0,2 µl
Cebador 2
0,2 µl
H2O
6,3 µl
Taq polimerasa
0,2 µl
ADN
1 µl

Programación del termociclador:

Tiempo
Temperatura
10 min.
94 ºC
1 min. (x30)
94 ºC
1 min. (x30)
66 ºC
1 min. (x30)
72 ºC
10 min.
72 ºC
indefinido
4 ºC

Resultado:

Mix PCR:
Volumen
Buffer
1 µl
MgCl2
0,7 µl
dNTPs
0,2 µl
Glicerol
0,5 µl
Cebador 1
0,2 µl
Cebador 2
0,2 µl
H2O
5,8 µl
Taq polimerasa
0,4 µl
ADN
1 µl

Programación del termociclador:

Tiempo
Temperatura
10 min.
94 ºC
1 min. (x30)
94 ºC
1 min. (x30)
64 ºC
1 min. (x30)
72 ºC
10 min.
72 ºC
indefinido
4 ºC

Resultado:

 

Mix PCR:
Volumen
Buffer
1 µl
MgCl2
0,6 µl
dNTPs
0,2 µl
Glicerol
0,5 µl
Cebador 1
0,2 µl
Cebador 2
0,2 µl
H2O
6,0 µl
Taq polimerasa
0,3µl
ADN
1 µl

Programación del termociclador:

Tiempo
Temperatura
10 min.
94 ºC
1 min. (x30)
94 ºC
1 min. (x30)
65 ºC
1 min. (x30)
72 ºC
10 min.
72 ºC
indefinido
4 ºC

Resultado:

 

@Jose A. Peña, 2012