Se estudia el fundamento teórico de dos herramientas típicas del bioquímico: la cromatografía y la electroforesis, así como sus aplicaciones prácticas. Como ejemplo representativo de la utilidad preparativa y analítica de estas técnicas se profundiza en la purificación y caracterización de proteínas y enzimas. También se estudia la forma de realizar ensayos en el laboratorio para determinar la actividad de un enzima y ponerlo en el contexto de la purificación enzimática. Una aproximación práctica y cuantitativa se consigue mediante las prácticas de laboratorio, la resolución de problemas y la simulación con ordenador.



Esta asignatura requiere que los estudiantes, además de en Bioquímica, tengan conocimientos de Química, Matemáticas y Física. La asignatura es básica en la formación de profesionales científicos, dado que se explican técnicas preparativas y analíticas imprescindibles para el ejercicio de su profesión. La asignatura utiliza de base los conocimientos adquiridos en otras materias ya cursadas (Bioquímica I, Bioquímica II, Metodología Bioquímica Básica), complementa otras cursadas a la vez (Biología Molecular e Ingeniería Genética, Tecnología del DNA recombinante) y asienta las bases de otras asignaturas posteriores (Biocatálisis, Procesos y Productos Biotecnológicos, entre otras).

Específicas:



Conocer las bases de la separación cromatográfica, técnicas electroforéticas, y sus aplicaciones en Bioquímica y Biología Molecular.



Tener capacidad de separar las sustancias aisladas de células vivas, y determinar sus estructuras y propiedades químicas y funcionales.



Al superar la asignatura, el estudiante debe ser capaz de entender las bases de la separación cromatográfica y electroforética de biomoléculas, así como de la purificación de proteínas y el ensayo de la actividad enzimática.



Transversales:



El estudiante y la estudiante aplica en los trabajos académicos los resultados de un proceso de indagación y/o de investigación teniendo en cuenta Objetivos de Desarrollo Sostenible.



El estudiante y la estudiante sintetiza y comunica de forma oral y escrita las ideas, haciendo uso de un lenguaje académico e integrando los términos vistos en la asignatura.

1. Técnicas cromatográficas.

2. Técnicas electroforéticas.

3. Purificación de proteínas y ensayos enzimáticos



Técnicas cromatográficas.

Introducción. Definiciones. Historia de la cromatografía. Teoría de la cromatografía. Clasificación de las técnicas cromatográficas. Cromatografía de reparto y adsorción. La banda y el pico cromatográfico. El equilibrio cromatográfico. Propiedades de la campana Gaussiana. Parámetros cromatográficos: tiempo y volumen de retención, factores de retención, retraso y separación. Componentes de un sistema cromatográfico. Cromatografía de adsorción. Cromatografía sobre hidroxiapatito. Cromatografía de interacción hidrofóbica. Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía de afinidad. Cromatografía de reparto. Cromatografía de tamizado molecular. Cromatografía en papel y en capa delgada. HPLC, UPLC y FPLC. Cromatografía de gases. Cromatografía de fluidos supercríticos.



Técnicas electroforéticas.

Introducción. Teoría de la electroforesis. Clasificación. Electroforesis en geles. Electroforesis bidimensional. Electroforesis en otros soportes. Inmunoelectroforesis. Ensayo de actividad en geles. Electroforesis capilar.



Purificación de proteínas y ensayos enzimáticos.

Estrategias y etapas de la purificación de proteínas. Controles de la purificación. Criterios de pureza. Tablas de purificación. Técnicas de aislamiento y purificación de proteínas recombinantes.

Actividad enzimática con extractos enzimáticos y con enzimas purificados. Enzimas interferentes y auxiliares. Ensayos acoplados. Métodos continuos y discontinuos. Curvas de progreso de la reacción. Caracterización cinética de un enzima.

Para seguir las explicaciones teóricas, los estudiantes disponen en el Aula virtual (e-Gela) de todas las diapositivas, lecturas complementarias y demás materiales docentes. Durante la explicación de las lecciones teóricas los estudiantes realizan prácticas de laboratorio y de simulación con ordenador de la purificación de proteínas. Los estudiantes reciben información sobre recopilación de artículos científicos relacionados con la purificación proteica para la realización el trabajo de Seminario. Finalmente, los estudiantes presentan en público el trabajo realizado con los artículos que han trabajado previamente.

• Sistema de Evaluación Final
• Herramientas y porcentajes de calificación:
  • -Prueba final: 65-75% -Trabajos realizados a lo largo de cuatrimestre (prácticas, seminarios, etc): 25-35% La suma total de los porcentajes será: (%): 100

Sistema de evaluación

La docencia magistral será evaluada por una prueba final que comprende preguntas relativas a las clases magistrales, prácticas y seminarios, y que representa el 65-75% de la nota final. Al resto de actividades (Seminarios, prácticas de laboratorio, resolución de ejercicios y de simulación con ordenador) se adjudicará el porcentaje restante (25-35%) hasta completar el 100%.Se requiere aprobar la prueba final con una nota igual o superior a 5 sobre 10 para hacer media con el resto de apartados de la asignatura.

Se realizará una actividad conjunta con la asignatura Tecnología del DNA Recombinante / Biología Molecular e Ingeniería Genética con el objetivo de integrar el conocimiento adquirido en sobreexpresión y purificación de proteínas. Además, se trabajará la competencia transversal Compromiso Social y Comunicación y Plurilingüismo.

La realización de las prácticas de laboratorio es obligatoria. No se podrá aprobar la asignatura si no se realizan las prácticas.

Bastará con no presentarse a la prueba final para que la calificación final de la asignatura sea no presentado o no presentada.



Ética académica y prácticas deshonestas

Esta asignatura se rige por el “Protocolo sobre ética académica y prevención de las prácticas deshonestas o fraudulentas en las pruebas de evaluación y en los trabajos académicos en la UPV/EHU”, con las consecuencias previstas en el apartado 5 de dicho protocolo.

La calificación obtenida en los apartados aprobados de prácticas y seminarios se mantendrá en la convocatoria extraordinaria del mismo curso académico.

No hay un único libro que pueda calificarse de libro de texto. Se dispone de una Aula virtual (e-Gela) abierta al inicio del curso en la que se incluyen materiales didácticos multimedia, lecturas complementarias y otras herramientas didácticas para seguir el curso. Para la simulación por ordenador se emplearán programas disponibles comercialmente.

Bibliografía básica

PRINCIPLES AND TECHNIQUES OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY. Keith Wilson and John Walker. 7th Ed. Cambridge Univ. Press, 2010



BIOCHEMICAL TECHNIQUES: THEORY AND PRACTICE, Robyt, J.F. and White, B.J. Waveland Press, Prospect Heights, 1990



BIOCHEMISTRY LABORATORY: MODERN THEORY AND TECHNIQUES. Rodney F. Boyer. Benjamin Cummings, 2006



FUNDAMENTAL LABORATORY APPROACHES FOR BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, A. J. Ninfa and D. P.Ballou, Wiley, 1998



PRINCIPLES AND TECHNIQUES OF PRACTICAL BIOCHEMISTRY, B.L. Williams and K. Wilson, Cambridge, Cambridge University Press, 2005



THE TOOLS OF BIOCHEMISTRY, Cooper, T. Wiley and Sons, New York, 1977



ENZYME ASSAYS. A PRACTICAL APPROACH. Eisenthal, R. and Danson, M.J. (eds) IRL Press, Oxford, 1992

Bibliografía de profundización

BIOTECHNOLOGY. A LABORATORY COURSE, Becker, J.M., Caldwell, G.A. & Zacho, E.A. Academic Press, San Diego,1996
PROTEIN METHODS, Bollag, D.M. and Edelstein, S.J. Wiley-Liss, Inc., New York, 1991
GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION, Deutscher, M.P. (Ed.) Methods Enzymology, vol 182, Academic Press, London,1990
PROTEIN PURIFICATION METHODS. A PRACTICAL APPROACH, Harris, E.L.V.& Angal, S. (Eds) IRL Press, Oxford,1989
PROTEIN PURIFICATION APPLICATIONS. A PRACTICAL APPROACH, Harris, E.L.V. IRL Press, Oxford, 1990
PROTEIN PURIFICATION PROTOCOLS, Doonan, S. (Ed.). Humana Press Inc., Totowa, NJ, 1996
ENZYME PURIFICATION AND RELATED TECHNIQUES, Jakoby, W.B. Academic Press, London, 1989
PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES, HIGH RESOLUTION METHODS AND APPLICATIONS, Janson, J.C. and Rydén, L. (Eds) Wiley VCH Publishers, Inc., New York, 1998
PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Scopes, R. Springer-Verlag, New York, 1998
A PRACTICAL GUIDE TO MEMBRANE PROTEIN PURIFICATION, von Jagow, G. and Schägger, H. (Eds.) Academic Press, New York, 1994

Revistas

Biochimica et Biophysica Acta, Journal of Biological Chemistry, Protein Expression and purification, Electrophoresis, Analytical Biochemistry

Direcciones web

Simulation software for protein purification (Prácticas de ordenador)
http://agbooth.com/pp_java/

Cytiva Chromatography Handbooks
https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/handbooks

Nomenclature for chromatography
http://publications.iupac.org/pac/1993/pdf/6504x0819.pdf

Chromatography simulator - Chromulator
https://people.ohio.edu/gu/CHROM/index_chrom.html

HPLC simulator
https://hplcsimulator.org/