Doctoral theses defended

Candida albicans kandidiasi inbaditzailearen eragile ohikoena da. Hala ere, beste espezie batzuk, Candida glabrata eta Candida auris kasu, patogeno oportunista garrantzitsuak bihurtu dira. Alderdi ekonomikoek, logistikoek eta etikoek animalia ornodunen erabilera gero eta gehiago murrizten dutenez, ordezko ereduak, hala nola, Caenorhabditis elegans nematodoak eta Galleria mellonella lepidopteroaren larbak, garrantzi berezia hartu dute. Doktorego-tesi honen helburua C. elegans eta G. mellonellaren erabilgarritasuna ikertzea izan zen kandidiasi inbaditzailearen eredu gisa, bai C. glabrata, Candida nivariensis, Candida bracarensis eta C. aurisen birulentzia aztertzeko, zein espezie horiek eragiten dituzten kandidiasien aurkako tratamendu antifungikoaren eraginkortasuna ebaluatzeko. Bi in vivo eredu horiek erabilgarriak izan ziren Candidaren espezie emergenteen birulentzia aztertzeko. C. glabrata espeziea harreman filogenetiko estua duten C. nivariensis eta C. bracarensis espezieak baino birulentoagoa izan zen. Gainera, G. mellonellaren hemozitoek C. bracarensisen aurka eragindako berezko erantzuna eraginkorragoa izan zen C. glabrata eta C. nivariensisen aurka eragindakoa baino. Fenotipo ez-agregatzailea zuten C. auris espeziearen isolamenduak, fenotipo agregatzailea zuen isolamendua baino birulentoagoak izan ziren bi kandidiasi-ereduetan. Odol-jatorriko C. aurisen isolamenduak gernu- eta orofaringe-jatorrikoak baino birulentoagoak izan ziren G. mellonella kandidiasi-ereduan. C. elegans eta G. mellonella kandidiasi-eredu baliagarriak izan ziren kandidiasien aurkako tratamendu antifungikoak ikertzeko. B anfoterizina eta azolak farmako eraginkorrenak izan ziren C. glabrata eta C. bracarensis espezieek eragindako infekzioen aurka C. elegans ereduan, ekinokandinak, berriz, aktiboenak izan ziren C. nivariensis espezieak eragindakoen aurkakoak. Ekinokandinen tratamenduan, kaspofungina eta mikafungina eraginkorrenak izan ziren C. glabrata eta C. nivariensis infekzioen aurka G. mellonella ereduan. C. bracarensis infekzioen aurka, aldiz, anidulafungina izan zen eraginkorrena. B anfoterizinaren eta ekinokandinen arteko konbinazioa eraginkorra izan zen C. auris espeziak eragindako infekzioen aurka C. elegans kandidiasi-ereduan, B anfoterizinaren eta kaspofunginaren arteko konbinazioa kandidiasi-eredu horretan erabilitako hiru konbinazioen artean eraginkorrena izan zelarik. Candida albicans es la causa más común de candidiasis invasiva. Sin embargo, otras especies, como Candida glabrata y Candida auris, se han convertido en patógenos oportunistas importantes. Los modelos de candidiasis en animales invertebrados, como el nematodo Caenorhabditis elegans y la larva del lepidoptero Galleria mellonella, han cobrado especial relevancia por evitar las restricciones éticas ligadas a los modelos murinos y proporcionar interesantes ventajas económicas, logísticas y de fácil manejo en el laboratorio. El objetivo del presente trabajo de Tesis doctoral fue estudiar la utilidad de C. elegans y G. mellonella como modelos de candidiasis invasiva para analizar la virulencia de C. glabrata, Candida nivariensis, Candida bracarensis y C. auris, y para evaluar la efectividad del tratamiento antifúngico contra las candidiasis que causan. Ambos modelos in vivo fueron útiles para el estudio de la virulencia de las especies emergentes de Candida. La especie C. glabrata fue más virulenta que sus especies filogenéticamente relacionadas, C. nivariensis y C. bracarensis. Además, la respuesta innata mediada por los hemocitos de G. mellonella fue más eficaz contra C. bracarensis que contra C. glabrata y C. nivariensis. Los aislamientos de la especie emergente C. auris con fenotipo no agregante fueron más virulentos que el aislamiento con fenotipo agregante en ambos modelos de candidiasis. Los aislamientos de C. auris provenientes de sangre fueron más virulentos que los provenientes de orina y orofaríngeos en el modelo de candidiasis en G. mellonella. Los modelos de candidiasis en C. elegans y G. mellonella fueron útiles para evaluar la terapia antifúngica contra las candidiasis. La anfotericina B y los azoles fueron los más activos contra la infección por C. glabrata y C. bracarensis, mientras que las equinocandinas lo fueron contra C. nivariensis en el modelo en C. elegans. En el tratamiento con equinocandinas, la caspofungina y la micafungina fueron más eficaces contra C. glabrata y C. nivariensis, mientras que la anidulafungina lo fue contra C. bracarensis en el modelo en G. mellonella. La combinación de anfotericina B y equinocandinas fue eficaz contra la infección por C. auris en el modelo de candidiasis en C. elegans, siendo la combinación de anfotericina B y caspofungina la más eficaz de las tres ensayadas en el modelo de candidiasis en C. elegans.

Este estudio inmunoproteómico ha permitido la identificación de antígenos de Lomentospora prolificans de relevancia para el diagnóstico y el tratamiento. Concretamente, se ha descrito una elevada prevalencia de reactividad de las IgA salivares de humanos sanos frente a la ciclofilina y la enolasa del hongo, lo que, junto a su localización en la superficie celular, hacen de estas enzimas unas candidatas potenciales a ser estudiadas como dianas terapéuticas o para el desarrollo de vacunas. Además, se ha demostrado la reactividad cruzada de estas enzimas con A. fumigatus, lo que puede ser de interés para el desarrollo de tratamientos eficaces frente a ambos géneros. Por otro lado, se ha demostrado que L. prolificans es más virulento que Scedosporium spp. y A. fumigatus. El estudio de los sueros obtenidos de infecciones murinas permitió la identificación de los antígenos inmunodominantes de L. prolificans. Algunas de las proteínas identificadas, como el receptor proteasomal de ubiquitina, CPY, Vps28, hidrolasa tipo HAD, GH16, Hp jhhlp_006787, la cerato-platanina y la Hsp70 pueden ser interesantes como dianas diagnósticas y terapéuticas.

El herpes genital (HG) es una de las infecciones de transmisión sexual (ITS) con mayor distribución en la población mundial con aproximadamente 500 millones de individuos afectados en todo el mundo. Además de presentar repercusiones físicas, psíquicas y económicas, el HG incrementa el riesgo de transmisión del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y durante el embarazo es causa potencial del herpes neonatal. Debido a las tendencias sociales, demográficas y migratorias actuales, la población expuesta a las ITS en general, y al HG en particular, seguirá aumentando de manera espectacular. La causa principal del HG es el virus herpes simple tipo 2 (VHS2), si bien en las últimas décadas se ha observado un incremento importante de esta afección debido al virus herpes simple tipo 1 (VHS1). La mejora en los hábitos de higiene y los cambios sociales del núcleo familiar han provocado el retraso en la adquisición de la infección del VHS1 orolabial a edades más tardías. Estos acontecimientos, junto con el inicio temprano de las prácticas sexuales, en especial, las orogenitales, han contribuido al cambio epidemiológico del HG. La enfermedad clínica del HG provocada por los dos tipos de VHS es indistinguible. Sin embargo, es importante conocer el tipo de VHS implicado en la infección genital debido a las diferencias que existen en cuanto a la vía de transmisión principal, el número de recurrencias clínicas y el riesgo de contagio. En España y en la Comunidad Autónoma del País Vasco, existen dos sistemas de información microbiológica, SIM y SIMCAPV respectivamente, que recogen las notificaciones de los aislamientos de VHS de muestras genitales confirmados en los principales Laboratorios de Microbiología. A nivel estatal el SIM recopila los aislamientos de los dos tipos de VHS implicados en la infección genital; el SIMCAPV, en cambio, sólo reúne las notificaciones de los aislamientos de VHS2, por lo que se desconoce con certeza la tasa de incidencia, la evolución y la implicación del VHS1 en el HG en nuestra Comunidad Autónoma. Las características clínicas así como los principales factores de riesgo sociales y sexuales asociados a este tipo de infección como el nivel de educación, el estado civil, la preferencia sexual, la edad del comienzo de las relaciones sexuales, el número de parejas o contactos sexuales, las prácticas sexuales, el empleo de los métodos anticonceptivos, el antecedente de otras ITS, etc. han sido analizados y evaluados principalmente en los estudios de seroprevalencia. Los grupos poblacionales en los que se ha aislado el VHS en muestras genitales proporcionan información epidemiológica más relevante y útil en torno al HG. Sin 2 embargo, los estudios realizados al respecto son escasos en nuestro entorno o han quedado obsoletos. Por estos motivos se ha planteado la elaboración de un estudio epidemiológico descriptivo del HG en la Organización Sanitaria Integrada Bilbao¿Basurto (OSI Bilbao¿Basurto) para conocer la incidencia y la evolución de los dos tipos de VHS de muestras genitales, además de comparar las características clínicas, epidemiológicas y sexuales de los individuos infectados, con el objetivo de enriquecer el conocimiento sobre el HG. En la presente tesis doctoral se han analizado 1516 muestras positivas a VHS de 1003 pacientes con HG. La tasa de incidencia de los pacientes con herpes genital en el área sanitaria OSI Bilbao¿Basurto de la comarca Bilbao ha aumentado el triple a lo largo del periodo estudiado. El 74% de los 1003 pacientes incluidos han presentado herpes genital por VHS2 (n=745) y el 25% por VHS1 (n=248). De acuerdo a los datos publicados en diferentes trabajos, en este estudio también se ha observado una tendencia creciente del número de pacientes con herpes genital por VHS1 (21% en el periodo 2004¿2007, 20% en el periodo 2008¿2011 y 31% en el último periodo 2012¿2015, p = 0,001), siendo este aumento mayor respecto a los sujetos con infección genital por VHS2 y más significativo en los hombres en comparación con las mujeres (28% en el primer periodo y 50% en el último). Las características sociodemográficas principales a nivel global de los casos de herpes genital corresponden, con ligera predominancia a los hombres (52%), con edad media de 34 años, autóctonos (57%), con nivel medio de estudios (56%) y atendidos en la consulta de ITS de Bombero Etxaniz (86%). Los factores de riesgo sexual observados en la mayoría de los pacientes son la orientación heterosexual (90%), tener pareja sexual estable (74%), un único contacto o pareja sexual en el último año (47%), última relación sexual en menos de 15 días al episodio de herpes genital (61%) y no emplear ningún tipo de medida contraceptiva (41%). Los episodios de herpes genital pertenecen predominantemente a recidivas clínicas (52%), con lesiones vesiculoulcerosas dolorosas genitales (95%), la mayoría tratadas con aciclovir (34%) y sin ninguna recurrencia posterior durante el periodo incluido (46%). Se han obtenido diferencias epidemiológicas, clínicas y pronósticas estadísticamente significativas en el análisis por tipo de VHS. La mayoría de los pacientes con HG por VHS2 son hombres (55%), mayores de 25 años, extranjeros, sobre todo procedentes de América (40%), y refieren en mayor proporción nivel de estudios básicos (32%). La etapa infecciosa habitual de este grupo es el episodio de recidiva clínica (63%), siendo la duración de los síntomas hasta la consulta médica más corta (58% entre 0¿4 días) y el número de recurrencias clínicas posteriores más alto (más de 6 recidivas clínicas al año en 15%) en éstos. Los perfiles sexuales correspondientes a uso de la prostitución (9%), ejercicio de la prostitución (7%), el antecedente 3 de haber ejercido la prostitución (4%) y el contacto previo con las lesiones herpéticas genitales de los contactos sexuales (18%) son más frecuentes en los pacientes con herpes genital por VHS2. Estos últimos datos coinciden con los datos publicados en la mayoría de los trabajos. Los pacientes con herpes genital por VHS1, en cambio, corresponden a mujeres (56%), menores de 25 años de edad, autóctonas (89%) y con nivel de estudios superiores (28%). El primer episodio clínico y/o la primoinfección es característico de este grupo (79%) y los síntomas locales diferentes a las lesiones herpéticas como sensación urente (37%), linfadenopatía inguinal (29%), prurito (27%) y disuria (14%), así como las manifestaciones sistémicas (11%) y el herpes bipolar (14 de 18 pacientes) son más frecuentes en los infectados por VHS1. El contacto previo con las lesiones herpéticas orolabiales de los contactos sexuales (23%), las prácticas sexuales orales (94%) y la orientación homosexual en los hombres (25%)son más habituales en este grupo. Otras ITS e infecciones genitales afectan con mayor frecuencia a los pacientes con HG por VHS2. En el presente trabajo las ITS previas significativamente más frecuentes en estos enfermos han sido los condilomas acuminados, la infección por VIH, la hepatitis B, la lúes, la infección por N. gonorrhoeae, la infección por T. vaginalis, la hepatitis C y la pediculosis púbica. En el análisis multivariante las variables predictoras asociadas de forma independiente con un mayor riesgo de herpes genital por VHS2 han sido la edad (OR 1,08 (IC95% 1,06¿1,10); p<0,0001), el lugar de nacimiento fuera de España (OR 8,26 (IC95% 5,22¿13,06); p<0,0001), el antecedente de infección por N. gonorrhoeae (OR 3,91 (IC95% 1,20¿12,73); p=0,0235), el haber tenido al menos un episodio previo de herpes genital (OR 2,92 (IC95% 1,98¿4,31); p<0,0001), el contacto previo con lesiones herpéticas genitales (OR 2,14 (IC95% 1,26¿3,64); p=0,0051) y el perfil sexual de riesgo relacionado con la prostitución (OR 2,08 (IC95% 1,06¿4,08); p=0,0328). Sin embargo, el contacto previo con lesiones herpéticas labiales se relacionó de manera independiente con un menor riesgo de herpes genital por VHS2 (OR 0,14 (IC95% 0,08¿0,27); p<0,0001). Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la presente tesis, sería interesante, de la misma manera en la que se realiza en el SIM, incorporar a las notificaciones de virus herpes simplex del SIMCAPV los aislamientos de VHS1 en muestras genitales para conocer su prevalencia y su impacto en la población general. Del mismo modo, sería de gran utilidad realizar una encuesta de seroprevalencia en la población general para obtener la información epidemiológica pertinente sobre las infecciones causadas por estos virus y la prevalencia de individuos inmunes y susceptibles. Autora: MIKELE MACHO AIZPURUA

La infección por Streptococcus pneumoniae es lamayor causa de morbilidad y mortalidad en el mundo. Globalmente el costo anual de la enfermedad neumocócica ha sido estimada en un millón de muertes anuales en niños menores de 5 años. La administración de las vacunas conjugadas en edad infantil ha conseguido reducir la enfermedad invasiva por este microorganismo. En esta tesis doctoral se ha analizado la administración de la vacuna antineumocócica conjugada 13-valente combinada con otras vacunas del calendario vacunal infantil como meningococo serogrupo C o las hexavalentes, la incidencia de la neumonía asociada con derrame pleural paraneumónico en vacunados, el efecto de la vacuna antineumocócida 13-valente en poblaciones especiales como son los prematuros o la importancia de los hemocultivos en la enfermedad neumocócica invasiva. Se ha concluido que esta vacuna 13-valente se demostró muy efectiva en prevenir la enfermedad neumocócica invasiva por los serotipos vacunales, que no interfiere con otras vacunas del calendario vacunal y puede administrarse concomitantemente con ellas, que es bien tolerada en prematuros y que la administración de esta vacuna consiguió disminuir el derrame pleural paraneumónico.

La infección persistente por el virus del papiloma humano (VPH) es un requisito imprescindible para el desarrollo del cáncer de cuello uterino (CCU), pero no suficiente puesto que sólo una baja proporción progresa a una lesión intraepitelial cervical (CIN) o un CCU. Esto hace pensar que son necesarios algunos cofactores que puedan favorecer dicha progresión. Uno de los cofactores más estudiado y que más influencia parece tener es la Chlamydia Trachomatis (CT). Tanto la infección por CT como la infección por VPH se trasmiten vía sexual y por tanto muchos factores relacionados con la adquisición de ambas infecciones son compartidos: edad joven, mayor número de parejas sexuales, la falta de utilización de método anticonceptivo de barrera¿ No es coincidencia por tanto que exista una mayor prevalencia de CT en pacientes infectadas por VPH. Pero la importancia de la relación entre ambos gérmenes radica no sólo en la mayor frecuencia de detección de CT en las pacientes VPH positivas, sino sobre todo en la influencia que puede ejercer ésta en la progresión de las lesiones causadas por VPH. Son numerosos los estudios epidemiológicos que relacionan la CT con el CCU y observan que la CT puede estar involucrada en la carcinogénesis cervical. Varios ejemplos son los estudios realizados por Antilla, Koskela, Golijow, Wallin, Smith, Valadan, Wohlmeister, Smith¿ En todos ellos, la infección por CT presenta un riesgo estadísticamente significativo de CIN o CCU escamoso. En contrapartida, también hay varios estudios publicados con resultados contraductorios, por lo que la relación entre HPV y CT continúa siendo controvertida y son necesarios más estudios para poder llegar a conclusiones más determinantes. El papel de la interacción entre la CT y el VPH en las células epiteliales del cérvix no se conoce con exactitud ni ha sido todavía demostrado, pero parece que la CT influye mediante diferentes mecanismos moleculares en la carcinogénesis cervical: - Induciendo metaplasia de las células cilíndricas endocervicales. Es bien sabido que el HPV tiene especial tropismo por estas células metaplásicas de la unión escamocolumnar y es ahí donde suele iniciarse la neoplasia cervical. - Produciendo microabrasiones y alterando las uniones entre las células epiteliales, dañando la barrera mucosa y facilitando así la entrada del VPH. - Produciendo inflamación crónica del tejido cervical, con segregación mediadores inflamatorios que pueden dañar las proteínas reparadoras del DNA o generar genotoxicidad directa, produciendo inestabilidad cromosómica - Inhibiendo la capacidad apoptótica de las células infectadas, favoreciendo su resistencia a la acción de las células Natural Killer CD8 - Favoreciendo la replicación del VPH o la fragmentación de su DNA, lo que facilitaría la integración del ADN viral en las células epiteliales. - Modulando la inmunidad cervical, lo que puede favorecer la persistencia del HPV. Objetivos El objetivo principal de nuestro estudio es determinar la prevalencia de infección por Chlamydia en pacientes con alteración cervical o vaginal por VPH y/o presencia de VPH en el tracto genital inferior. Los objetivos secundarios del estudio son: - determinar la prevalencia de infección por Chlamydia en los diferentes grupos de edad y en relación a otros factores como tabaco, método anticonceptivo, pareja estable o paridad - determinar la prevalencia de infección por Chlamydia en relación con los distintos genotipos de VPH (16, 18 y otros de AR) y con infecciones por otros microorganismos - determinar la prevalencia de infección por Chlamydia en las diferentes alteraciones citológicas y en la patología cervical confirmada histológicamente - establecer la influencia de la Chlamydia Trachomatis en el aclaramiento del VPH y en la evolución de las lesiones intrapeteliales a corto plazo Material y métodos Estudio retrospectivo realizado mediante la revisión de 1229 historias de pacientes que acuden a la Unidad de Patología cervical del Hospital Universitario Basurto a realización de una colposcopia durante los años 2013 y 2014. Se incluyen 640 pacientes con VPH AR (+) y/o con alteración histológica confirmada mediante biopsia colposcópica (CIN1+). Todas las pacientes fueron además sometidas a un estudio más completo de enfermedades de transmisión sexual mediante la toma de cultivos vaginales y endocervicales (para bacterias, hongos, Mycoplasma, Ureaplasma, Trichomonas, Neisseria Gonorrhoeae y Chlamydia Trachomatis) y serologías. Resultados La prevalencia de Chlamydia es del 6,4% en las pacientes con VPH o con lesiones producidas por este virus en el tracto genital inferior. Este dato triplica la prevalencia de Chlamydia en la población general en la misma zona, que según estudios realizados recientemente es de aproximadamente un 1,8%. La prevalencia es aún mayor en las mujeres menores de 30 años, donde alcanza el 11,3%. Observamos también que la infección por CT es más frecuente en las pacientes remitidas a colposcopia por una alteración citológica leve. Respecto al seguimiento de las lesiones intaepiteliales, observamos una peor evolución de las en las pacientes con CT que en las pacientes CT negativas. En las pacientes CT positivas, el VPH presenta menor tasa de aclaramiento y las lesiones tienen más riesgo de persistir o progresar en el control realizado a los 6 ó 12 meses, siendo estos resultados estadísticamente significativos en el caso de las lesiones CIN 1. Conclusiones Tal y como avalan numerosos estudios, si ya es importante el cribado de la CT y otras ITS en pacientes sanas, es aún más interesante dicho cribado en pacientes portadoras del VPH o con lesiones producidas por el mismo. Los motivos son principalmente la mayor prevalencia de CT en estas pacientes y los efectos que ésta produce en la transformación maligna de las células cervicales infectadas por VPH. De esta manera se detectarían muchos casos de infección por CT que podrían ser tratados, evitando así sus consecuencias tanto por su posible implicación en la génesis de las lesiones cervicales como por su papel determinante como microrganismo causante de importantes cuadros de salpingitis o peritonitis.

Las candidiasis orales son infecciones fúngicas comunes, causadas principalmente por Candida albicans. Sin embargo, actualmente otras especies de Candida menos sensibles a los fármacos antifúngicos han aumentado su prevalencia. Además, la formación de biopelículas y la resistencia a los antifúngicos modifican la resolución de la infección. La búsqueda de alternativas terapéuticas basadas en fitocompuestos obtenidos de la naturaleza sigue siendo un reto permanente. Como parte de este trabajo de Tesis, se evaluó la prevalencia de especies estrechamente relacionadas a Candida glabrata y Candida parapsilosis en una colección de aislamientos orales de la UPV/EHU. Se identificó un aislado de Candida metapsilosis y Candida orthopsilosis, pero se observó ausencia de Candida bracarensis y Candida nivariensis. C. glabrata fue la segunda especie de Candida más frecuente, seguida de C. parapsilosis. En algunos aislamientos de ambas especies se observó resistencia cruzada a los azoles. La evaluación de la actividad anticandidiásica de los monoterpenos y otros fitocompuestos mostró que el cinamaldehído, el timol, el carvacrol y el citral eran los agentes más activos contra las células planctónicas de Candida, y también inhibían la formación de las biopelículas. El citral también fue activo contra las biopelículas maduras al reducir su actividad metabólica, mientras que el carvacrol y el timol también redujeron la biomasa de las biopelículas. Además, se evaluó el efecto combinado de citral y fluconazol contra Candida y su efecto sobre la expresión de los genes ERG11, MDR1 y CDR1 asociados a la resistencia al fluconazol. Se obtuvo un efecto sinérgico in vitro e in vivo con la combinación de citral y fluconazol contra células planctónicas y sésiles de Candida, y en un modelo de candidiasis de Caenorhabditis elegans. El citral redujo la expresión de MDR1 cuando se combinó con fluconazol. Para mejorar la biodisponibilidad de los fitocompuestos, desarrollamos y caracterizamos liposomas basados en DODAB:MO de carvacrol, cinamaldehído, citral y timol. Estas nanopartículas fueron estables durante al menos cinco semanas, redujeron significativamente la citotoxicidad y, excepto los liposomas de citral, mantuvieron su actividad anti-Candida. Las nanopartículas de carvacrol y timol fueron las formulaciones más prometedoras para tratar la candidiasis. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de los fitocompuestos y los sistemas de administración de fármacos para combatir la candidiasis.

La infección gonocócica, causada por la bacteria Neisseria gonorrhoeae, es la segunda infección de transmisión sexual de etiología bacteriana más prevalente en la actualidad. El aumento de la incidencia de la infección, junto con el aumento de la resistencia a los antimicrobianos utilizados para su tratamiento anteriormente y en la actualidad, puede llevar a una situación de infección intratable en ciertas circunstancias. Ante esta situación, en el presente proyecto se ha realizado la identificación de los casos de infección gonocócica de los años 2014 y 2015 en el Hospital Universitario Basurto de Bilbao, junto con las pruebas de sensibilidad antimicrobiana de los aislados de N. gonorrhoeae mediante las técnicas difusión en agar disco-placa, E-test y dilución en agar, además del genotipado de los aislados mediante la técnica NG-MAST. Los resultados muestran un aumento de la incidencia de la infección gonocócica en nuestra área sanitaria. Se ha observado una alta tasa de resistencia a azitromicina y los primeros casos de sensibilidad disminuida a ceftriaxona, dos de los antimicrobianos recomendados en la actualidad para el tratamiento de la infección gonocócica. La técnica NG-MAST ha mostrado 71 secuenciotipos y tres genogrupos diferentes, y se ha observado la relación del genogrupo 1407 con la resistencia a azitromicina y la sensibilidad disminuida a cefixima y ceftriaxona.

La permanencia de los microorganismos en los sistemas naturales está condicionada por factores ambientales cambiantes. En los últimos años, se ha incrementado la detección de cepas patógenas del género Vibrio y la incidencia global de enfermedades relacionadas con usos de agua. En este estudio se ha desarrollado un protocolo CARD-FISH para la detección de Vibrio spp. en ambientes naturales y se ha estudiado su distribución estacional en aguas costeras del golfo de Vizcaya. Además, se ha determinado el efecto de la variación de factores ambientales abióticos y bióticos en la supervivencia de las bacterias del género Vibrio aisladas en nuestras costas. Se han establecido patrones de supervivencia diferentes entre especies y también entre cepas ambientales y de colección de una misma especie. Por otra parte, se ha realizado un análisis comparativo de las variaciones del subproteoma de las envueltas celulares de V. harveyi ambiental mantenido a 2 temperaturas diferentes. A partir de esta información, se cuestiona la adecuación del uso de cepas modelo para profundizar en el conocimiento de la supervivencia y ciclo de vida de Vibrio spp.

La clase Gammaproteobacteria es una de las más diversas del dominio Bacteria tanto taxonómica como metabólicamente. Gracias a su diversidad y plasticidad genómica, las gammaproteobacterias son ubicuas y pueden encontrarse en diversidad de entornos. Para prosperar en condiciones cambiantes, las bacterias deben adaptarse y, consecuentemente, despliegan diferentes mecanismos de regulación que resultan en cambios proteómicos y transcriptómicos. Dos miembros notables de la clase Gammaproteobacteria son Escherichia coli y Vibrio harveyi. E. coli pertenece a la familia Enterobacteriaceae y es un miembro común de la microbiota intestinal del ser humano. La microbiota intestinal podría verse afectada por los sulfitos, comúnmente usados como conservantes alimenticios. A pesar de que estudios recientes han revelado sus efectos en levaduras y células de mamífero, todavía no se conocen sus efectos en enterobacterias. En este estudio utilizamos diferentes técnicas de biología molecular para revelar los cambios proteómicos y transcriptómicos que E. coli experimenta en respuesta a la presencia de sulfitos. Nuestros datos sugieren que la exposición a una concentración subletal de sulfitos es capaz de inhibir temporalmente el crecimiento bacteriano. En esta fase de inhbición, E. coli reprograma su expresión genética para eliminar los sulfitos y minimizar sus efectos potencialmente dañinos en biomoléculas. V. harveyi es una bacteria acuática perteneciente a la familia Vibrionaceae. A diferencia de otros miembros de la familia, V. harveyi está menos estudiado y los elementos clave de su genoma se desconocen. En este estudio recurrimos a la secuenciación diferencia de RNA para construir un mapa de sitios de inicio de la transcripción, revelando el transcriptoma primario de V. harveyi así como numerosos nuevos genes y RNAs antisentido potencialmente involucrados en el control de la adaptación bacteriana al estrés.

El pez cebra es un modelo animal muy utilizado en los últimos años por sus homologías con los humanos. En esta tesis se proponen nuevos usos de este. Se ha querido investigar si el pez cebra tanto en fase larvaria como adulto es un buen prototipo para el estudio de las interacciones entre la microbiota y el hospedador. Para ello se propone un modelo de pez cebra humanizado con la microbiota de un donante humano y de determinan las especies que son capaz de colonizarlo. Por otro lado, se propone el estudio de la evolución de la microbiota y del sistema inmune del pez cebra tanto en fase larvaria como adulta en respuesta a una dieta alta en grasa y la suplementación de la misma con aceite de pescado. Gracias a estos dos estudios se ha visto que la dieta alta en grasa produce inflamación intestinal, cambios en la microbiota, cambios en el perfil lipídico y en el metabolismo de la microbiota. Además, el aceite de pescado es capaz de revertir ciertos cambios negativos producidos por la dieta alta en grasa. Así, se propone que la microbiota del pez cebra es modulable por la dieta, al igual que ocurre en humanos. Por tanto, se concluye que el pez cebra es un buen modelo para el estudio de la microbiota, y de las interacciones entre la flora y el hospedador.

Acinetobacter baumannii is a Gram-negative opportunistic pathogen causing serious hospital-acquired infections and it has been recently positioned as a priority pathogen by the World Health Organization. It has been described causing outbreaks worlwide and its antimicrobial resistance has been worryingly rising in recent times. A. baumannii usually causes infections such as ventilator associated pneumonia, septicaemia, urinary tract infections, wound infections or meningitis, especially in compromised patient groups such as those admitted to ICU and elderly patients, increasing the mortality rates and hospitalization costs. Other species belonging to the A. baumannii group are being described more often lately as causing infections and sometimes related to antimicrobial resistance determinants. This work is focused in the study of A. baumannii isolates recovered from clinical samples in the two main hospitals of Cochabamba, Bolivia, Hospital Materno-Infantil and Hospital Viedma. The present work is divided in four sections. Sections 1. The epidemiology and antibiotic resistance genes were studied in A. baumannii isolates from a Children Hospital. Section 2. We studied molecular epidemiology by cgMLST and resistome of CRAb isolates from the two main hospitals of the city of Cochabamba. Section 3. Study of the mobile genetic elements encoding antibiotic resistance genes in A. baumannii isolates belonging to different ICs. Section 4. Identification of Acinetobacter seifertii, an A. baumannii group member, isolated from both hospitals in Cochabamba.

Campylobacter spp. es el agente etiológico de la enteritis de transmisión alimentaria de mayor incidencia en los países desarrollados, ocasionando serias repercusiones socio-económicas. Un buen conocimiento de los diferentes aspectos epidemiológicos de Campylobacter en los principales reservorios es crucial para diseñar intervenciones efectivas en el sector primario, la base de la cadena alimentaria. Para ello, esta Tesis Doctoral ha abordado el estudio de Campylobacter en dos de las principales fuentes de infección para el humano, los rumiantes domésticos y los pollos de engorde. Por un lado, dada la limitada información existente, se ha realizado un estudio transversal para estimar la prevalencia de C. jejuni y C. coli en las explotaciones rumiantes del País Vasco (vacuno de leche, vacuno de carne y ovino de leche) así como la distribución de las resistencias antimicrobianas de las cepas circulantes. Por otro lado, se ha llevado a cabo un estudio experimental en pollos de engorde (broilers Ross-308) para evaluar el efecto de dos aditivos en pienso (lactosuero seco en polvo - un prebiótico y butirato cálcico - un ácido orgánico en forma de sal) sobre la colonización y los niveles de excreción de Campylobacter. Además, se ha investigado la compleja comunidad microbiana (microbiota) del ciego, lugar donde Campylobacter convive con muchos otros microorganimos, estudiando el efecto de la edad, raza y dieta. Los resultados obtenidos resaltan la importancia de los reservorios no avícolas de Campylobacter y la alta diversidad y dinámica de la microbiota cecal de los pollos de engorde refleja un complejo ecosistema potencialmente modulable para disminuir la carga no solo de Campylobacter sino de diferentes patógenos.

El objetivo principal fue valorar el comportamiento de la papila implante-diente con el uso de un implante de 2,9 mm frente a un implante de 3,3 mm de diámetro en incisivos laterales superiores e incisivos inferiores. Así mismo, se valoró la estabilidad de los tejidos, la tasa de supervivencia y el grado de satisfacción del paciente con el resultado de dicho tratamiento. Material y métodos: cuarenta pacientes fueron seleccionados para colocar implantes de 2,9 mm (20 en el grupo test) y de 3,3 mm de diámetro (20 en el grupo control), ambos de Ti-Zr por un único operador. Un examinador calibrado y cegado evaluó el índice papilar de Jemt (IPJ), la tasa de supervivencia, los parámetros clínicos de la mucosa periimplantaria, la aparición de complicaciones y el grado de satisfacción del paciente. Resultados: al cabo de 1 año se examinaron los 40 pacientes. No hubo diferencias significativas entre ambos grupos en el IPJ, la tasa de supervivencia (100%), los parámetros clínicos y las complicaciones. En cuanto al grado de satisfacción, los resultados fueron similares excepto en la autoestima que fueron significativamente mejores en el grupo test. Conclusión: los implantes de Ti-Zr de 2,9 mm de diámetro para rehabilitar dientes unitarios en zonas del sector anterior, donde la distancia mesio-distal es limitada, han demostrado resultados clínicos favorables durante 1 año de observación.

El bacterioplancton es el componente biológico más importante en la transformación y mineralización de la materia orgánica en los sistemas acuáticos. La eficiencia de crecimiento bacteriana es el parámetro que mejor integra todos los procesos metabólicos que determinan esta función ecológica crucial en el ciclo del carbono. Sin embargo, los problemas metodológicos asociados a la determinación de la eficiencia de crecimiento bacteriana y la incertidumbre acerca de los factores que regulan su magnitud, dificultan nuestro conocimiento sobre el flujo de carbono en los sistemas acuáticos. Con el objetivo general de contribuir a la comprensión y predicción del flujo del carbono en los sistemas acuáticos, en esta tesis doctoral se establece una metodología adecuada para la determinación de la eficiencia de crecimiento bacteriana, y se profundiza en el conocimiento de los factores que regulan esta variable en sistemas marinos costeros.

Los small RNAs (sRNAs) son moléculas de ARN no codificantes de corta longitud que regulan la estabilidad y traducción de ARN mensajeros (sus mRNA dianas), y que a menudo están implicados en el control de respuestas bacterianas al estrés ambiental (por ejemplo, escasez de hierro o de nutrientes, temperaturas o pH sub-óptimos, etc.). Numerosos estudios se han centrado en identificación y caracterización de sRNAs en bacterias, resultando en alrededor de un centenar de sRNAs identificados en Escherichia coli. Aunque algunos han sido profundamente caracterizados, las dianas y las funciones reguladoras de la mayoría de sRNAs identificados aún no se conocen. Dado el papel esencial que juegan en la adaptación y supervivencia de las bacterias en ambientes adversos y condiciones cambiantes, la identificación de los sRNAs existentes y su caracterización son de vital importancia para profundizar en el conocimiento de la regulación de las respuestas bacterianas al estrés. . En este trabajo hemos utilizado un nuevo microarray del diseño propio para análisis de la expresión génica y hemos demostrado su eficacia para la detección y medida de la expresión de sRNAs y sus mRNAs dianas. Además, hemos analizado la expresión de sRNAs en E. coli mediante secuenciación de ARN (RNA-seq). Nuestro estudio demuestra la expresión in vivo de 6 sRNAs nuevos y 10 sRNAs previamente predichos, y hemos descrito por primera vez la regulación de la expresión de algunos sRNAs (tanto completamente nuevos como sRNAs predichos y anotados) en distintas condiciones de crecimiento, ampliando el número de sRNAs verificados y aportando nueva información acerca de algunos de ellos. Por último examinamos las diferencias y similitudes experimentales de estudios de RNA-seq en E. coli, comparando sus metodologías y resultados en la búsqueda de sRNAs y planteando un método comparativo para seleccionar los sRNA candidatos de forma eficiente para su posterior análisis y validación por northern blot.

La fiebre Q es una zoonosis de distribución mundial causada por la bacteria intracelular Coxiella burnetii. Los pequeños rumiantes, el ganado ovino y caprino, son los principales reservorios de Coxiella. En este trabajo de tesis se ha estudiado la prevalencia de fiebre Q en la Comunidad Autónoma Vasca en explotaciones de ganado ovino hallando un 23% de rebaños infectados. El estudio de la cinética de excreción de Coxiella en 4 rebaños ovinos naturalmente infectados durante 4 parideras consecutivas, ha mostrado que la infección puede perdurar al menos durante 5 años, originando contaminación en el entorno de las explotaciones afectadas lo que supone un riesgo potencial de contagio para las personas. Tanto en estos rebaños ovinos como en un rebaño caprino que sufrió un brote de fiebre Q con un 80% de abortos, se comprobó que las principales vías de excreción de Coxiella en los animales infectados eran los exudados vaginales y las heces, y, en último lugar la leche. En ambos estudios se pudo demostrar la presencia de la bacteria en los aerosoles, así como la viabilidad de la bacteria en muestras de polvo recogidas en el momento de la paridera, lo que supone un riesgo de infección para animales susceptibles, y para el personal que frecuenta las explotaciones afectadas por fiebre Q. Además, se pudo comprobar que hay 2 genotipos predominantes infectando el ganado ovino y caprino, y ambos han sido relacionados con casos humanos de fiebre Q. Por último, se detectó ADN de Coxiella en quesos elaborados con leche cruda, y se demostró la viabilidad de Coxiella a lo largo de todo el periodo de maduración, lo que indica que, aunque todavía no hay evidencias claras, no se puede descartar la posible transmisión de C. burnetii por vía oral.

Invasive fungal infections caused by Candida species, among which Candida albicans is the predominant one, are the fourth cause of nosocomial infections. Most Candida infections are treated with azoles, thus, acquisition of resistance to these compounds extremely hinders the treatment options. In the recent years, there has been an increase in azole resistance, and azole tolerance is also gaining importance since it is considered to facilitate resistance development and recurrent or persistent infections. There are several well-established azole resistance mechanisms, but there are also reports of resistant clinical isolates without any of the aforementioned. In this work we have determined the presence of these known mechanisms in a collection of C. albicans strains and concluded that further research in this area is still needed to elucidate alternative resistance mechanisms. In addition, we have identified new mutations in resistance-associated genes that had not yet been reported in the literature and tested their involvement in azole resistance by means of CRISPR-Cas9 gene editing; nevertheless, we could not link these new mutations to fluconazole resistance in the C. albicans SC5314 background. We also performed an alternative approach to investigate the development of resistance to antifungals by means of an in vitro evolution experiment with two azole-susceptible C. albicans strains, SC5314 and BE-47, that were exposed to increasing concentrations of fluconazole for 23 days. After only 4 days of fluconazole exposure, the C. albicans SC5314 strain acquired a mutation in Tac1 known to be associated to azole resistance that became homozygous by the 7th day of exposure. The occurrence of this mutation was correlated with an increase in MIC values for azoles and expression of target genes and was maintained throughout the whole experiment. Conversely, the BE-47 strain did not acquire azole resistance nor presented any of the described resistance mechanisms, but it increased its tolerance to fluconazole after the exposure period. These populations constitute a very interesting material warranting future studies of the mechanisms involved in the acquisition of azole tolerance and/or resistance.

Las infecciones nosocomiales se han incrementado en las últimas décadas, y las levaduras del género Candida ocupan el cuarto lugar entre los agentes etiológicos identificados. Los pacientes con deficiencias inmunológicas tienen un alto riesgo de sufrir una candidiasis invasora (CI), aunque el uso profiláctico de fluconazol ha desviado la incidencia a pacientes con otras características: cirugía gastrointestinal, ingreso prolongado en UCI, antibioterapia de amplio espectro, catéter venoso central, diabetes y neonatos de bajo peso. El hemocultivo, método diagnóstico de CI de referencia, ofrece una baja sensibilidad (aprox. 50%) y puede tardar 24-48h en mostrar un resultado positivo. Un retraso de 12-24h en el tratamiento antifúngico puede doblar la mortalidad por candidemia, por lo que se requieren nuevos tests diagnósticos o identificar factores de riesgo que permitan adelantar el tratamiento antifúngico específico. Nuestro Grupo de Estudio de la Infección Fúngica Invasora (GEIFI) se centra en los métodos de diagnóstico y prevención de la CI, así como en la mejora de su tratamiento, y ha desarrollado una técnica de inmunofluorescencia indirecta para la detección de anticuerpos específicos (CAGTA) frente a antígenos de la pared celular de los tubos germinales de C. albicans asociados al proceso invasivo del hongo. Se han identificado varios antígenos de C. albicans reconocidos por los CAGTA, entre los que podemos citar hyphal wall protein (Hwp1), agglutinin-like sequence 3 (Als3) o methionine synthase (Met6). Estos antígenos reconocidos por CAGTA podrían constituir la base para el desarrollo futuro de vacunas frente a esta infección, y algunos como la Als3 están en fase de ensayo clínico para la candidiasis vulvovaginal recurrente. Esta tesis pretende evaluar la utilidad diagnóstica de los antígenos Hwp1, Als3 y Met6, producidos de forma recombinante, para el diagnóstico de la CI mediante la detección de anticuerpos específicos. De forma paralela, se estudia el posible efecto protector de dichos antígenos como vacuna frente a la CI. Se ha determinado la presencia de anticuerpos frente a los antígenos Hwp1, Als3 y Met6, mediante ensayos ELISA, así como niveles de CAGTA y la concentración de beta-glucano (BDG) en sueros de 297 pacientes diagnosticados de infección fúngica invasora y controles, todos ellos con factores de riesgo para sufrir una CI. Se determinó la utilidad diagnóstica de las distintas pruebas por separado y en combinación. La detección de CAGTA presentó valores de sensibilidad moderados, sin embargo, destaca por su alta especificidad >90%, y mejoraba su rendimiento global rebajando el punto de corte de 1/160 a 1/80, tanto en pacientes inmunocompetentes como en inmunodeprimidos. El ensayo ELISA anti-Als3 presentó mejores resultados diagnósticos en pacientes inmunocompetentes en comparación con los ELISA anti-Hwp1 y anti-Met6. Por el contrario, en pacientes inmunodeprimidos la detección de anticuerpos anti-Met6 mostró los mejores índices de utilidad diagnóstica. La combinación de resultados de BDG y CAGTA (1/80) alcanzó el mejor rendimiento para el diagnóstico de CI en pacientes inmunocompetentes. En cambio, para pacientes inmunodeprimidos, la mejor combinación fue la de la prueba ELISA anti-Met6 con la detección de CAGTA. Dado que los pacientes con CI desarrollaban anticuerpos frente a los antígenos Hwp1, Als3 y Met6, se diseñó un experimento de inmunización frente a la CI en modelo murino, basado en estas proteínas. Se seleccionó, para cada uno de ellos, una secuencia de 15-18 aminoácidos contenida en epítopos de modelos teóricos, y se construyó un péptido complejo (3P-KLH) con espaciadores glicina-prolina (GPGPG) y secuencias key li (LRMKLPKS) para mejorar la presentación de los epítopos, y conjugado a KLH como proteína transportadora. Los ratones fueron inmunizados con dos dosis de 3P-KLH, separadas 21 días, y el grupo control solo recibió KLH. Veintiún días después de la segunda inmunización se procedió a la inoculación intravenosa de los ratones con levaduras de C. albicans. En comparación con el grupo control, cuya media de supervivencia fue 6 días, en los ratones inmunizados con 3P-KLH la carga fúngica en riñones fue 30 veces inferior y a los 21 días de seguimiento se registró una supervivencia del 37,5%.

La paratuberculosis (PTB) bovina es una enteritis granulomatosa crónica causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) que afecta a rumiantes tanto domésticos como silvestres. El control de la enfermedad se fundamenta en la aplicación de medidas higiénico-sanitarias en las explotaciones y en el diagnóstico y eliminación de animales infectados. Sin embargo, el diagnóstico de animales infectados con MAP está fuertemente condicionado por la falta de sensibilidad de las técnicas diagnósticas disponibles. Estas limitaciones inciden sobre la necesidad de desarrollar nuevas estrategias de control de la PTB que permitan la detección de animales con infección subclínica o la selección genética de animales naturalmente resistentes a la infección. En la presente Tesis Doctoral hemos identificado mediante análisis transcriptómico (RNA-seq), genes diferencialmente expresados en muestras de sangre periférica (PB) y válvula ileocecal (ICV) de animales con diferentes tipos de lesiones asociadas a la PTB (focales y difusas) respecto a animales control (sin lesiones). El análisis proporcionó información valiosa sobre la respuesta del hospedador a una infección natural con MAP, y permitió identificar genes, procesos biológicos, rutas metabólicas y redes de proteínas, desregulados en animales con lesiones focales y difusas que no habían sido previamente descritos, como la inhibición de la vía de señalización de CXCL8/IL8. El número de genes diferencialmente expresados fue mayor en muestras de ICV que en muestras de PB. Se identificaron cinco genes diferencialmente expresados en muestras de PB e ICV, independientemente del tipo de lesión, incluyendo el CXCL8/IL8, APOLD1, IFI27, KIAA1324L y ARAP2. Así mismo se identificaron 2 rutas metabólicas enriquecidas comunes a PB e ICV de los animales con lesiones difusas: respuesta defensiva (GO:0006952) y respuesta inmune (GO:0006955). El gen más sobre expresado en las muestras de ICV, independientemente del tipo de lesión, fue el precursor de la intelectina 2 (ITLN2), lo que sugería que podría ser utilizado como biomarcador de la infección por MAP en muestras de tejido. Por otro lado, el gen más sobre expresado en muestras de PB de animales con lesiones focales, el transportador ABCA13, fue seleccionado como un posible biomarcador de la infección subclínica. En estudios realizados posteriormente en colaboración con el departamento de Sanidad Animal del SERIDA, se confirmó y validó el potencial de la ITLN2 y del ABCA13 como biomarcadores diagnósticos facilitando ambos la detección de animales con lesiones focales, y difícilmente detectables con los métodos tradicionales de diagnóstico. La integración de datos de expresión génica obtenidos mediante RNA-seq y datos de genotipado de 14 animales infectados con MAP en condiciones naturales, permitió la identificación de 192 y 48 cis-eQTLs reguladores de la expresión de 145 y 43 genes en PB e ICV, respectivamente. Tres de estos cis-eQTLs regulaban la expresión de los genes MECOM (rs43744169), eEF1A2 (rs110345285) y U1 (rs109859270) y fueron asociados con la susceptibilidad a la infección por MAP mediante un estudio de asociación genética dirigida. En dicho estudio, se incluyeron los genotipos para los cis-eQTLs identificados y los datos fenotípicos (histopatología, ELISA, PCR y cultivo bacteriológico) de 986 animales de una población independiente. El genotipo heterocigoto para el rs43744169 (T/C), regulador del gen MECOM, se asoció con una sobreexpresión del gen MECOM, resultados positivos a los test de ELISA, PCR y cultivo bacteriológico, con mayores niveles de MECOM en el plasma de animales infectados con MAP, con una mayor supervivencia intracelular de MAP en ensayos ex vivo llevados a cabo con macrófagos bovinos y con una mayor riesgo de progresión a PTB clínica. Nuestros resultados sugieren que determinadas variantes alélicas del cis-eQTL regulador de la expresión del gen MECOM, un regulador transcripcional de la respuesta inflamatoria mediada por el NF-¿ß, podrían causar una respuesta inflamatoria incontrolada y progresiva que exacerbaría el daño tisular en los animales infectados por MAP. En la presente Tesis Doctoral también se han llevado a cabo tres análisis de asociación a genoma completo utilizando datos de genotipado imputado a secuencia completa y fenotipos antemortem (ELISA, para la detección de anticuerpos frente a MAP) y postmortem (PCR y cultivo de tejidos, para la detección de MAP, y análisis histopatológico de lesiones intestinales). La combinación de varios test diagnósticos mejoró las estimas de heredabilidad respecto al uso de test individuales remarcando la importancia de una correcta definición del fenotipo. En el primer estudio, la combinación de ELISA-PCR-Cultivo (h2= 0,139) permitió identificar 159 SNPs asociados a la susceptibilidad a la infección por MAP. En el segundo estudio se identificaron un total of 192 and 92 SNPs asociados (P < 5 × 10¿7) con la presencia de lesiones multifocales (h2= 0,075) y difusas (h2 = 0,189), respectivamente. Asimismo se identificaron genes candidatos implicados en el proceso de queratinización en los animales con lesiones multifocales, mientras que en los animales con lesiones difusas se identificaron genes candidatos relacionados con el metabolismo del colesterol lo que se confirmó funcionalmente al detectarse niveles más bajos de colesterol en el plasma de animales con lesiones difusas. En el tercer estudio de asociación llevado a cabo, se buscaron variantes asociadas con la tolerancia a la PTB. Se consideró que un animal era tolerante cuando era positivo a PCR y cultivo bacteriológico de tejidos pero no presentaba de lesiones asociadas a la PTB en tejido intestinal. La heredabilidad del fenotipo de tolerancia a la PTB fue alta (h2= 0,55), identificándose 40 SNPs (P < 5×10-7), 9 QTLs y 98 genes candidatos asociados a este fenotipo. El análisis de enriquecimiento funcional utilizando los genes candidatos identificados permitió definir un perfil inmunogenético específico en los animales tolerantes, diseñado para reparar daños en el DNA, controlar la carga bacteriana, modular la inflamación, limitar el daño tisular, y favorecer el establecimiento de una infección persistente, En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral proporcionan información nueva y global acerca de los mecanismos moleculares subyacentes a la susceptibilidad a la infección por MAP y tolerancia a la PTB con aplicaciones en el diagnóstico y control de la enfermedad. El uso de algunos de los biomarcadores identificados mediante RNA-seq ha permitido el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas para la detección de animales subclínicos, difícilmente detectables con los métodos diagnósticos tradicionales. Además, los SNPs identificados podrían ser integrados en los programas de selección de ganado bovino asistidos por marcadores con el objetivo de seleccionar animales menos susceptibles a la infección y más tolerantes a la PTB lo que redundará en una mejor sanidad y bienestar animal, mayor longevidad, reduciría los costes económicos de las explotaciones, minimizaría el uso de agentes antimicrobianos y la aparición de resistencias a los mismos. La consiguiente reducción de MAP ambiental redundaría en un beneficio para la salud pública, especialmente si se confirma una relación causal entre MAP y la enfermedad de Crohn.

La sepsis, una disfunción orgánica potencialmente letal causada por una respuesta desregulada frente a una infección, es una de las entidades nosológicas con mayor morbilidad y mortalidad a nivel global. Pese a ser secundaria a una infección solo se identifica el agente causal en el 60 % de los casos y de estos hasta en un 40 % se aíslan en el torrente sanguíneo. Debido a ello, el estudio de la presencia de bacterias en la sangre, la bacteriemia, es una de las principales preocupaciones de la microbiología clínica. En este trabajo se ha desarrollado una nueva técnica de extracción bacteriana abreviada aprovechando las características líticas de algunos frascos de hemocultivos: el método Ultrarrápido o método UF. Este método ha sido empleado para la utilización de los frascos de hemocultivo positivos directamente en la identificación de los microorganismos causantes de la bacteriemia, para la realización de estudios de sensibilidad y para la realización de secuenciación de genoma completo. La espectrometría de masas y en especial el MALDI-TOF (del inglés Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization ¿ Time Of Flight) ha supuesto una revolución en la identificación de microorganismos en microbiología, en este estudio se ha empleado el método UF para la realización de MALDI-TOF desde hemocultivos positivos con buenos resultados. El método UF ha conseguido mejores resultados que el método empleado previamente en nuestro laboratorio, el método de doble centrifugación, siendo además más económico y rápido. El método UF también ha tenido un rendimiento no inferior al método establecido previamente, el método del tubo separador de suero, para la realización de estudios de sensibilidad automatizados mediante el sistema Phoenix BD, reduciendo también el coste económico y agilizando el proceso. La secuenciación bacteriana de genoma completo permite recuperar toda la información genética contenida en una determinada cepa bacteriana. En este caso mediante el método UF se consigue obtener el material genético bacteriano presente en un hemocultivo positivo y secuenciarlo obteniendo un genoma con una calidad y cobertura suficientes para su estudio. Mediante este sistema se consigue recuperar información sobre el secuenciotipo bacteriano, los determinantes de resistencia y virulencia y las estructuras plasmídicas que permiten vehiculizarlos.

In the last decades, the incidence of Invasive Candidiasis has dramatically increased. Since Candida is a common component of human microbiota, the distinction between invasion and colonization is complicated. Our group of research developed an immunofluorescence assay to detect antibodies reacting specifically against the surface of the germ tubes of Candida albicans in those patients with Invasive Candidiasis (IC). These antibodies appear when an invasive process occurs and have been referred to as CAGTA. The mortality rate of ICU patients was significantly lower in CAGTA positive patients. Based on this premise, we decided to characterize the antifungal activity of anti-Candida albicans germ tube antibodies (CAGTA). In the first part of this study, we worked with the immune sera obtained from two White New Zealand female rabbits infected intravenously with C. albicans blastospores. We confirmed that both sera antibodies recognize superficial antigens from blastospores and mycelia of C. albicans. In addition, specific IgG titers increased along the infection process, after several C. albicans inoculations. Secondly, we developed several ELISA assays in order to study the kinetics of the antibodies raised in the animal model. We used the following recombinant proteins of C. albicans: 14-3-3, Adh1, Als3-N, Eno-1, Hwp1-N, Met-6, and an eluted fraction of approximately 45 kDa of a C. albicans cell wall extract (CW-Eno). According to the recorded activity, anti Adh1 and anti-Met 6 antibodies could contribute to the immunofluorescence reaction against C. albicans registered for sera of the rabbit model of IC. Contrarily, the early response of anti-Eno 1, anti-CW-Eno and anti-Hwp1 N suggest that their corresponding proteins play an important role as immunogens during the first stages of Candida infection. In addition to the previously identified antigens recognized by CAGTA, we searched for new targets of these antibodies using a cDNA library prepared in the vector Lambda Zap II from mRNA of C. albicans SC5314 growing as mycelia. The screening of the expressed proteins with the CAGTA-enr serum fraction of the IC rabbit model showed 5 clones which correspond to five C. albicans SC5314 proteins: glucose-6-p-isomerase (PGI1), hyphal wall protein (Hwp1), fatty acid synthase (FasI), pH responsive protein 1 (Phr1), and actin (Act1). The CAGTA-enr fraction from patients with IC also recognized the selected clones and therefore, these antigens could be the basis for the future development of immunization protocols that might protect against Candida infections. In the next section of this work, we measured the effect of CAGTA raised in a rabbit model of IC, on C. albicans planktonic cells as well as on the process of biofilm formation and biofilm maturation. We observed that total-IgG and CAGTA-enr IgG fraction from rabbit immune serum reduced the growth of cells in a concentration dependent manner. In addition electron microscopy images of blastospores and hyphal forms of C. albicans treated with CAGTA-enr revealed an altered surface of hyphae. Besides, fluorescent DiBAC and CFDA staining of C. albicans cells treated with CAGTA revealed that these antibodies exerted a fungicidal effect. The same results were obtained using antibodies from patients with IC caused by Candida albicans. However, when patients were infected with C. parapsilosis, C. glabrata or C. tropicalis, their CAGTA-enr serum fractions reduced C. albicans metabolic activity to a different extent, with a mean value of 50-60% inhibition compared to the untreated control. In conclusion the CAGTA-enriched fraction appears as the main responsible for the in vitro antifungal effect on viability and metabolic activity of C. albicans observed for the IC immune sera. We also analyzed the phases of biofilm formation of C. albicans following different time-based protocols of treatment with CAGTA. The presence of CAGTA only during the first 90 minutes of incubation, corresponding to the C. albicans adhesion step, resulted in a significant reduction of the biofilm biomass down to 48% while the metabolic activity remained close to the control group values. In agreement with the observed effect of CAGTA on C. albicans biofilm formation, electron micrographs of 24-hour old biofilms treated with CAGTA exhibited a reduction of the microbial structure density; in addition, fungal filaments appeared rough and with protuberances, when compared to the untreated control. In the last section of this work, the following experiments performed during a stay at Dr Naglik¿s laboratory (King¿s College, London; September-December 2016) aimed to increase our knowledge of C. albicans pathogenicity and the ability of Candidalysin peptide to promote damage and generate an immunological response. First of all, we confirm that Kex1p activity appears as an important requirement for candidalysin maturation being Candidalysin terminating in K residue the mature peptide. In addition, we observed that all Candidalysin variants used in our assays presented a dosage effect on epithelial damage induction (LDH assay). In this regard, based on the results obtained, C terminal K residue seemed not be critical for interacting with the negative charge of epithelial cells surface. These results suggest that despite being different in their amino acid sequences, the function of Candidalysin peptides is conserved

En este trabajo se ha estudiado la capacidad de la bacteria marina Vibrio harveyi para adaptarse a la escasez de nutrientes a diversas temperaturas que puede encontrarse de forma natural en su ecosistema. Para ello se llevaron a cabo tres experimentos similares a 4, 20 y 30ºC en agua de mar previamente esterilizada y filtrada para eliminar posibles fuentes de alimento. Para entender los mecanismos de adaptación que usa la bacteria a estas temperaturas, se procedió a analizar microscópicamente el tamaño y forma que adquiere a lo largo del tiempo, y también se extrajo el ARN para estudiar a nivel de transcriptoma la regulación que se da en cada caso particular. Encontramos que la bacteria responde de forma diferente dependiendo de la temperatura de incubación. Como era de esperar responde bien a 20ºC, ya que V. harveyi crece bien en temperaturas templadas. Sin embargo, a 4ºC se ve afectada, y a 30ºC es incapaz de hacer frente correctamente a este estrés. Interesantemente, muchos brotes se dan a elevadas temperaturas, y ya que se ha detectado un aumento significativo en genes relacionados con la virulencia, es posible que este aumento en la patogenicidad se deba a una estrategia de la bacteria para intentar sobreponerse a la adversidad.

Aspergillus fumigatus is a filamentous fungus capable to cause a wide range of diseases depending on the immune status of the patient who breath its conidia. The most dangerous disease caused by this fungus is known as invasive aspergilosis and its diagnosis and treatment is frequently delayed and useless. Therefore, describing new virulence factors that could serve as new diagnostic or therapeutic targets is crucial. In this PhD thesis, we have designed a whole genome transcriptomic study in different infection conditions with the aim to define which Aspergillus fumigatus genes are differentially expressed during the infective process. The project is divided in three related chapters in which we have defined genes that could be important for the establishment and development of the Aspergillus fumigatus infection. Specifically, we have found that during the first 96 hours of an intranasal infection, the genes related with the biosynthesis of fumagillin/pseurotina, several genes that codify proteases (dppIV, dppV, aspf1 or aspf5), chitinase (chiB1) as well as some genes related with pyomelanin biosynthesis (hppD and maiA) are overexpressed. Furthermore, we have described that fumagillin could be an important virulence factor for the fungus because this mycotoxin causes cell death and inhibition of the cell metabolism and proliferation. In the same way, the toxin is a protective factor against phagocytosis and plays an important role during the infection process. Finally, using CRISPR-Cas9 technology we have proved that Aspergillus fumigatus maiA gene is involved in the fungal cell wall synthesis, the correct hyphae development and the fungal virulence.

Candida albicans is a human commensal yeast that can sometimes cause life-threatening infections, especially in immunocompromised patients. The high mortality rates associated with this fungus make necessary the study of new diagnostic techniques and alternative therapies. In this PhD thesis, five proteins of the yeast (Adh1, Eno1, Ilv5, Kre9 and Qcr2) were produced as recombinant proteins, which showed ability to stimulate the hepatic endothelial cells, leading to an increase in tumor cell adhesion. Monoclonal antibodies against two of those proteins, Adh1 and Kre9, were also generated and tested against C. albicans. Those antibodies were able to reduce the C. albicans stimulatory effect on hepatic endothelial cells, reducing the tumor cell adhesion. On the other hand, one of the antibodies, anti-Kre9, showed ability to differentiate C. albicans from Candida dubliniensis and clinically relevant filamentous fungi. The other antibody, anti-Adh1, showed ability to effectively reduce yeast growth in vitro, to reduce the necessary antifungal dose to inhibit the fungus, and to increase survival in a Galleria mellonella animal infection model. The data presented here point out Adh1 and Kre9 proteins as relevant new candidates to be diagnostic and/or treatment targets to improve the outcome of patients suffering from C. albicans infections.

Este trabajo se ha centrado en el estudio de la composición taxonómica de la comunidad bacteriana en aguas superficiales de un sistema marino costero del Mar Cantábrico oriental durante un periodo plurianual, combinando diferentes técnicas moleculares y frecuencias de muestreo. Se observaron dos situaciones estacionales: invierno, con dominancia de Alfaproteobacteria, y verano, con dominancia de Bacteroidetes, conectadas por dos momentos de transición, en abril y septiembre, en los que ocurrieron cambios en la composición y eficiencia de crecimiento de las comunidades bacterianas. Además, las comunidades bacterianas adheridas y de vida libre mostraron una marcada estacionalidad, y su composición se vio afectada por distintos factores. Por último, el análisis de la sensibilidad a la temperatura de tres bacterias habituales en este sistema acuático indicó que la respiración fue la actividad más sensible a la temperatura, lo que permite predecir un incremento en la transferencia de CO2 a la atmosfera en un contexto de calentamiento climático.

En las últimas décadas ha habido un incremento significativo de las infecciones fúngicas en humanos debido a los avances médico quirúrgicos que han permitido la supervivencia de pacientes vulnerables. Los géneros Candida y Aspergillus ocupan el primer y segundo lugar, respectivamente, como causa de fungemia nosocomial. Candida albicans es la especie prevalente y, en combinación con Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis y Candida krusei representa el 90% de las micosis invasoras. Además, hay un número creciente de especies fúngicas que, aprovechando las condiciones de inmunosupresión de los pacientes, causan infecciones menos comunes, pero con una alta tasa de mortalidad, destacando los géneros Cryptococcus, Pneumocystis, Fusarium, Scedosporium, Rhizopus, Mucor o Saprochaete entre otros. Por otro lado, el aumento de estas especies menos comunes ha ido acompañado de un aumento de aislamientos con sensibilidad reducida a los fármacos antifúngicos, capaces de producir infecciones de brecha. El inicio temprano del tratamiento adecuado es fundamental para la supervivencia de estos pacientes, sin embargo, las técnicas de diagnóstico empleadas suelen ser laboriosas y lentas en proporcionar resultados. En este sentido, la biología molecular ofrece herramientas sencillas y rápidas para la identificación del patógeno fúngico y para la evaluación de la sensibilidad del microorganismo a los compuestos antifúngicos. En este trabajo de tesis se ha desarrollado un ensayo de qPCR multiplex útil para la detección e identificación de las 6 especies más frecuentes del género Candida, el cual ha podido ser validado con muestras clínicas de origen oral y vulvovaginal. Asimismo, se han identificado en aislamientos de C. albicans resistentes a antifúngicos mutaciones en los genes ERG11, TAC1 y UPC2, relacionadas en la literatura con la sensibilidad reducida a azoles. Por otro lado, se ha desarrollado un segundo ensayo de PCR que ha permitido la identificación específica de Saprochaete capitata directamente de muestras de sangre y de muestras clínicas incluidas en parafina, y se ha identificado una sustitución natural en la primera base de la región Hot Spot 1 del gen FKS que podría ser responsable de la sensibilidad reducida a equinocandinas que posee esta especie fúngica de manera intrínseca. Los ensayos aquí presentados, aunque preliminares, suponen una herramienta prometedora para su empleo tanto en la identificación del agente etiológico causante de la infección fúngica.

En los últimos años, el aumento de las infecciones causadas por especies diferentes de Candida albicans y la aparición de aislamientos resistentes o con sensibilidad reducida al fluconazol ha adquirido gran importancia. Este estudio tiene como objetivo evaluar la actividad anticandidiásica tanto in vivo como in vitro de la combinación de fluconazol con otros fármacos utilizados para el tratamiento de otras enfermedades:. amiodarona, ciclosporina A,ibuprofeno y lactoferrina. La actividad antigúngica de los fármacos se determinó mediante los métodos de microdilución en caldo propuestos por el Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI) en el documento M27-A3 y por el European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST) en el documento EDef 7.3.1. Las interacciones entre los medicamentos se estudiaron mediante la técnica del tablero de ajedrez y las curvas de letalidad. Para la interpretación de los resultados obtenidos con la primera de las técnicas mencionadas se utilizaron los modelos de índice de concentración inhibidora fraccionada (FICI) y el modelo de variación del porcentaje de crecimiento (AE). Los estudios in vivo se llevaron a cabo en un modelo de infección en Galleria mellonella. Nuestros resultados mostraron una muy buena concordancia al comparar los diferentes métodos con un valor de coeficiente de correlación intraclase mayor de 0,8. Además los modelos empleados para la interpretación de las interacciones entre el fluconazol y los distintos agentes mostraron similitud. Por otro lado, la combinación del fluconazol y el resto de agentes redujo la concentración mínima inhibitoria (CMI) del fluconazol contra un gran número de aislamientos resistentes a este fármaco antifúngico. El fluconazol combinado con la ciclosporina A mostró efecto sinérgico contra 16 de los 32 aislamientos estudiados, siendo la mitad resitentes al fluconazol. La interacción entre fluconazoly lactoferrina teambién mostró buenos resultados, el efecto contra 15 de los 32 aislamientos analizados fue sinérgico. Los resultados obtenidos mediante las curvas de letalidad confirmaron los resultados obtenidos mediante el modelo del tablero de ajedrez contra algunos aislamientos de Candida. El tratamiento con la combinación de fluconazol y ciclosporina A de la candidiasis experimental por Candida Krusei ATCC 6258 en el modelo en Galleria mellonella mostró una mejora en la supervivencia de las larvas. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo infectado y tratado con esta combinación de fármacos respecto al grupo de larvas control. La interacción del fluconazol con la ciclosporina A presentó muy buenos resultados in vivo e in vitro contra aislamiento de Candida resistentes al fluconazol.

La tipificación molecular de regiones microsatélites (STR), es una herramienta de genotipado que posibilita el estudio de las relaciones filogenéticas entre diferentes aislamientos de microorganismos, con aplicaciones muy diversas en epidemiología y microbiología molecular como puede ser la investigación de brotes asociados a infecciones (sean nosocomiales o comunitarias) para identificar los posibles mecanismos de transmisión de las mismas en la población. El presente trabajo de Tesis Doctoral pretende avanzar en la utilidad y aplicabilidad de la genotipado mediante STR de la levadura Candida parapsilosis sensu stricto, desarrollando y validando un nuevo protocolo de detección múltiple con un esquema de amplificación touchdown, adaptando el protocolo singleplex original publicado por Sabino et al. en 2010. Durante la etapa de validación se estudiaron la eficacia (utilizando cepas de referencia) como la efectividad (empleando aislamientos clínicos de Candida parapsilosis sensu stricto obtenidos de pacientes con candidemia asociada a dispositivos intravasculares) del nuevo método. Para completar dicho análisis se valoró la concordancia del nuevo método frente al de referencia y se analizó del poder discriminativo de dicha técnica mediante la estimación de cuatro parámetros (PIC, índice de Simpson, heterocigosidad estimada y la entropía). Los resultados obtenidos estimaron unos valores de sensibilidad y especificidad del 100%, con unos intervalos de confianza al 95% (IC95%) entre 0,158 - 1, y 0,753 ¿ 1 respectivamente. Asimismo, la concordancia entre ambas técnicas (nueva y original) fue perfecta (índice Kappa: 1 IC95%) lo que garantiza que el método optimizado es equivalente al protocolo original, permitiendo el acortamiento de realización de la técnica hasta la obtención de los resultados, permitiendo su simplificación de la técnica y abriendo la posibilidad de su automatización. Por último, cabe resaltar que el nuevo método, permitió identificar de manera más fiable las candidemias relacionada a catéter poder establecer relaciones filogenéticas entre las muestras tanto de sangre como de catéter en función de su genotipo y no sólo de su especie tal y como viene haciéndose en la práctica clínica. Por este motivo, la técnica descrita y propuesta en el presente trabajo puede contribuir a la mejora del diagnóstico, tratamiento y manejo de las candidiasis invasivas causadas por Candida parapsilosis sensu stricto.

La mayoría de los pacientes hospitalizados son portadores de dispositivos biomédicos. Las infecciones asociadas a estos dispositivos causan gran morbilidad y mortalidad, especialmente en pacientes en unidades de cuidados intensivos. Se han diseñado numerosas estrategias para prevenir el desarrollo de biopelículas sobre biomateriales; sin embargo, la formación de biopelículas es un proceso complejo que depende de diversos factores. En el presente trabajo de Tesis doctoral se analizó la rugosidad e hidrofobicidad de diferentes biomateriales para evaluar su influencia en la formación de biopelículas en cuatro de los principales agentes etiológicos de las infecciones asociadas a la atención sanitaria y se comparó la biopelícula formada sobre diferentes materiales empleados en implantología dental utilizando el reactor de biopelículas CDC. Además, se evaluó la influencia del medio de cultivo tanto en la formación de biopelícula como en la capacidad de diversos fármacos antifúngicos para inhibirla. Los resultados obtenidos mostraron que existe una relación entre la rugosidad del biomaterial y la formación de biopelícula, pero que ésta se ve opacada por la hidrofobicidad del material, siendo los materiales más hidrófobos en los que se adhería un mayor número de microorganismos independientemente de su rugosidad. Por su parte, las resinas empleadas en implantología oral permitieron mayor formación de biopelícula en comparación con otros materiales metálicos. También se observó que la composición del medio de cultivo es un factor determinante en el estudio de biopelículas de Candida por su efecto significativo sobre el crecimiento, la formación de biopelícula y la actividad de los fármacos antifúngicos.

ES: La candidiasis invasora es una enfermedad potencialmente mortal causada por especies del género Candida. El pronóstico de esta enfermedad está estrechamente relacionado con el diagnóstico precoz; sin embargo, el hemocultivo, el actual estándar para el diagnóstico, tiene una baja sensibilidad y tarda días en proporcionar resultados. La detección de anticuerpos contra los tubos germinales de Candida albicans (CAGTA) mediante inmunofluorescencia indirecta ha surgido como alternativa, pero esta técnica tiene limitaciones que pueden superarse identificando las dianas específicas de estos anticuerpos. Con este fin, hemos analizado una librería de expresión de ADNc de C. albicans utilizando para ello suero inmune de un modelo animal de candidiasis invasora, identificando 5 proteínas como posibles dianas: la aminopeptidasa 2 (Ape2), la subunidad gamma del coatómero (Sec21), la cistationina gamma-liasa (Cys3), la enolasa 1 (Eno1) y la proteína de la pared regulada por las hifas (Hyr1). El análisis in silico de las 5 proteínas llevó a la selección de Hyr1 para continuar con su estudio como potencial biomarcador para el diagnóstico de la candidiasis invasora; del mismo modo, también se seleccionó un fragmento de la proteína, que denominamos D22b. Durante la caracterización de esta proteína se observó que el gen que la codifica, HYR1, presenta alta variabilidad dentro de la especie C. albicans, mostrando algunos de los alelos identificados una asociación estadísticamente significativa con la localización anatómica de los aislamientos. En relación con la utilidad de Hyr1 como biomarcador, la detección de anticuerpos contra Hyr1 y su fragmento D22b, fue útil para el diagnóstico de pacientes con candidiasis invasora, no sólo las causadas por C. albicans sino también por otras especies de Candida, con valores de sensibilidad y especificidad superiores al 70% y 80% respectivamente, y en algunos casos, anticipando el diagnóstico con respecto al hemocultivo. Por último, el desarrollo de anticuerpos monoclonales contra un posible péptido antigénico de la proteína dio lugar a dos anticuerpos de cadena simple que reconocían la proteína recombinante y que en un futuro podrían ayudar a caracterizar, diagnosticar o combatir las infecciones por Candida. EN: Invasive candidiasis is a life-threatening disease caused by Candida species. The prognosis of this disease is closely related to early diagnosis; however, blood culture, the current gold standard for the diagnosis of invasive candidiasis, has a low sensitivity and takes days to provide results. Detection of antibodies against Candida albicans germ tubes (CAGTA) by indirect immunofluorescence has emerged as an alternative, but this technique has limitations that can be overcome by identifying the specific targets for these antibodies. With this aim, we analysed a cDNA expression library of C. albicans using immune serum from a rabbit model of infection, and 5 proteins were identified as potential targets: aminopeptidase 2 (Ape2), coatomer subunit gamma (Sec21), cystathionine gamma-lyase (Cys3), enolase 1 (Eno1) and hyphal-regulated cell wall protein (Hyr1). The in silico analysis of the 5 proteins led to the selection of Hyr1 for further study as a potential biomarker for the diagnosis of invasive candidiasis; similarly, a subterminal fragment of the protein, which we named D22b, was also selected. During the characterisation of this protein, we found that the encoding gene HYR1 presents high variability within the C. albicans species, and some of the identified variants showed a statistical association with the anatomical origin of the isolates. Regarding the usefulness of Hyr1 as a biomarker, the detection of antibodies against Hyr1 and the D22b fragment was able to differentiate patients with invasive candidiasis, not only those caused by C. albicans but also by other Candida species, with sensitivity values >70% and specificities >80%, and in some cases, anticipating the diagnosis with respect to blood culture. Finally, the development of monoclonal antibodies against a possible antigenic peptide of the protein resulted in two single-chain antibodies that recognised the recombinant protein and could help characterise, diagnose or combat Candida infections in the future.

Scedosporium and Lomentospora genera are emergent fungal pathogens ranking the second, only behind Aspergillus spp., among filamentous fungi causing a chronic colonization of the airways of CF patients. This may lead to chronic inflammation or even to life-threatening invasive disease in cases of severe immunosuppression. The detection of these microorganisms is currently performed by non-standardized and low-sensitivity culture-based methods. With this concern, the aim of this thesis project was to gain insights into the immunodiagnosis of Scedosporium/Lomentospora fungi in CF patients. In this thesis project different protein extracts ¿ including a total whole cell protein extract from conidia and hyphae (Total WCP), secreted proteins (Secretome), conidial and hyphal cell surface associated proteins (Total CSP) and conidial surface associated proteins (Conidial CSP) ¿ were studied by ELISA to select the most useful for anti-Scedosporium/Lomentospora-IgG detection in sera from CF patients. Furthermore, a rapid Dot Immunobinding Assay (DIA) that employed S. boydii Total WCP was developed. This rapid system allowed a naked-eye detection of anti-Scedosporium/Lomentospora-IgG in 15 minutes in sera from CF patients with a sensitivity and specificity of 90.48% and 79.30%, respectively. Finally, an immunoproteomics-based study was performed to identify the S. boydii antigens specifically recognized by serum IgGs from CF patients and infected mice. In this sense, 22 proteins were identified as specific antigens. After evaluating their diagnostic capacity by in-gel purification and western blotting with individual sera, 4 proteins in particular stood out as novel promising diagnostic targets which might be included in future diagnostic methods.

Urteetan zehar giza papilomaren birusak (GPB) umetoki-lepoko minbiziarekin eta haren lesio preneoplasikoekin duen lotura aztertu da. Halaber, GPBaren eragina beste kokapen batzuetan ere ezaguna da, hala nola baginan, bulban, zakilean eta uzkian. Azken urteetan, birus honek orofaringeko minbizian duen papera geroz eta gehiago aztertzen ari da. Horrela, birusak aho-barrunbean duen prebalentzia eta kartzinogenesian inplikatutako beste aldagai batzuk ezagutzea minbizi orofaringeoaren agerpenean erabakigarria dela dirudi. Azterlan honetan, GPBak zerbixean duen eraginaren eta birus horrek orofaringean duen presentziaren arteko lotura aztertu da. GPBaren infekzioa denboran zehar mantentzea umetoki-lepoko minbizia garatzeko arrisku-faktore garrantzitsuena da. Birusak irauteko arriskuan hainbat faktorek eragiten dute, horien artean isolatutako GPBaren genotipoa erabakigarria izanik. Lan honetan, genotipo bakoitzak gure ingurunean duen prebalentzia aztertu da, genotipo onkologikoenak zeintzuk diren zehaztuz, genotipo bakoitzaren infekzioaren ostean azaldutako lesio intraepitelialen tasan oinarrituta. Datu horiek umetoki-lepoko kartzinogenesiarekin zerikusia duten beste aldagai batzuekin erlazionatu dira: erretzeko-ohitura, erabilitako antisorgailua, seme-alaba kopurua, sexu-portaera, koinfekzioa eta GPBaren aurkako txertoa, besteak beste. A lo largo de los años se ha estudiado ampliamente la relación del virus del papiloma humano (VPH) con el cáncer cervical y sus lesiones preneoplásicas. Así mismo, está documentada la carga de enfermedad asociada al VPH en otras localizaciones anogenitales como la vagina, vulva, pene y ano. Sin embargo, el papel que desempeña este virus en otras enfermedades como el cáncer orofaríngeo está actualmente en estudio. Este trabajo tiene como objetivo el estudio de los cofactores implicados en la carcinogénesis cervical, tanto el análisis de las características de los diferentes genotipos del VPH como el conocimiento de las variables relacionadas con la infección viral. De esta manera determinaremos mejor cómo se comporta el virus y cómo es capaz de producir lesiones en cérvix y en orofaringe. La persistencia de la infección VPH es el factor de riesgo más importante para desarrollar cáncer de cérvix en la mujer. Varios factores influyen en el riesgo de persistencia viral, entre los que destaca el genotipo viral. En este trabajo se ha analizado la prevalencia de cada genotipo en nuestro medio, así como cuales son los genotipos más oncológicos, basándonos en la tasa de lesiones intraepiteliales objetivadas en relación a cada genotipo. Estos datos se han relacionado con otras variables implicadas en la carcinogénesis cervical, entre las que destacan: el hábito tabáquico, el método anticonceptivo utilizado, la paridad, el comportamiento sexual, la coinfección y la vacunación frente a este virus.

Candida albicans is an opportunistic pathogenic fungus capable of reaching the bloodstream and causing disseminated infections. This thesis aimed, firstly to clarify the mechanisms activated in liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) by C. albicans and, secondly, to examine the effect exerted by C. albicans on tumor cells. In this regard, the results determine that C. albicans is capable of inducing an inflammatory response initiated by its recognition by Toll-like receptors (TLRs) and C-type lectin receptors (CLRs) present in LSECs, leading to the activation of the MAPK/c-Fos pathways, mainly through ERK1/2, JNK, and p38, inducing a cytokine-mediated inflammatory response and a metabolic reprogramming that enables its energy sustenance. In relation to melanoma cells, in vitro and in vivo assays reveal that the fungus promotes adhesion to endothelial cells, migration, the generation of a pro-angiogenic environment, the Warburg effect, and metastasis in melanoma cells, favoring tumor development and progression. Although additional transcriptomic analyses and in vitro assays suggest the involvement of the MAPK/p38 pathway, further studies are required to clarify the underlying mechanisms. In summary, this work indicates that the presence of C. albicans could lead LSECs to promote a pro-inflammatory and pro-metastatic microenvironment, while melanoma cells may undergo phenotypic and metabolic changes, increasing their metastatic potential.

La sepsis es un síndrome clínico de extrema gravedad, con una tasa de mortalidad elevada, una incidencia creciente e importantes costes asociados. Las tasas de morbimortalidad están relacionadas con el retraso en la administración del primer antimicrobiano apropiado. Puesto que el tratamiento empírico se basa en la epidemiología local, es fundamental el seguimiento continuo de las tendencias temporales en la tasa de incidencia, la distribución de especies y los perfiles de sensibilidad a antimicrobianos clave. Además, es importante garantizar que las infecciones del torrente sanguíneo se diagnostican correctamente y que los microorganismos causales, sus sensibilidades y las posibles fuentes primarias de infección se evalúan minuciosamente para permitir una terapia antimicrobiana dirigida óptima. Este trabajo se centra en el estudio del diagnóstico microbiológico de bacteriemia y fungemia por cultivo, analizando la epidemiología, etiología y perfiles de resistencia de los principales microorganismos responsables de infección del torrente sanguíneo a antibióticos clave aislados en el Laboratorio centralizado de Microbiología del Hospital Universitario de Araba durante un período de seis años (2015-2020), evaluando dos ensayos rápidos de antibiograma directo, e investigando el papel potencial del tiempo de positivización en el diagnóstico de bacteriemia. Así mismo, se evalúa el impacto de la pandemia por SARS-CoV-2 en la utilización de hemocultivos y se describen las características de la bacteriemia en pacientes infectados con SARS-CoV-2.

El principal objetivo del estudio fue evaluar la relación de la alergia ¿-Gal en el área de Bilbao con la picadura de la garrapata Ixodes ricinus; y como objetivos secundarios, caracterizar a la población y determinar la relación con la alergia a productos lácteos. Se realizó un estudio de casos y controles prospectivo intervencionista en individuos ¿18 años con datos disponibles sobre los niveles de IgE específica a ¿-Gal entre 2016 y 2022. Se recogieron características sociodemográficas, clínicas y de casuística en ambos grupos, y en el grupo de casos se realizaron diversas pruebas complementarias. Se incluyeron 32 casos y 65 controles. Se ha evidenciado una asociación con el sexo, una historia de picaduras de garrapatas y la exposición a las mismas. El SDS-PAGE Immunoblotting con los extractos de glándula salivar y sistema digestivo de garrapata de I. ricinus, ha mostrado una zona de unión de IgE de alta intensidad con el suero de 7 pacientes analizados; y el SDS-PAGE Immunoblotting-inhibición con dichos extractos, mostró una inhibición completa de la fijación de IgE en la mayoría de los sueros analizados. El SDS-PAGE Immunoblotting-inhibición con los sueros de 2 pacientes con alergia a queso de oveja, mostró una inhibición total de la unión de la IgE sobre el extracto de leche de oveja. Por tanto, la picadura de la garrapata I. ricinus en el área de Bilbao se relaciona con la alergia a ¿-Gal. El epítopo ¿-Gal también está involucrado en el reconocimiento de la IgE específica de pacientes con alergia a queso de oveja en el Síndrome de alergia a ¿-Gal .

La peri-implantitis (PI) es un trastorno inflamatorio-infeccioso multifactorial que condiciona la pérdida progresiva del hueso de soporte. Todavía no se conocen todos los factores involucrados en su desarrollo y su verdadera patogenia. Hemos realizado un estudio de casos y controles sobre pacientes con PI de la CAPV, analizando la susceptibilidad genética mediante el estudio de polimorfismos genéticos (SNPs) relacionados con la respuesta inflamatoria y el remodelado óseo. También hemos realizado la caracterización citológica de la mucosa peri-implantaria en este trastorno, así como su utilidad diagnóstica. Finalmente, hemos investigado la presencia del hongo Candida spp. y su rol patogénico. La aparición de PI se ha asociado a SNPs de los genes GBP1, BRINP3, OPG, BMP4 y FGF3, sin que su presencia incremente el riesgo de desarrollar la enfermedad. La presencia de células epiteliales, microbiota simple, polimorfonucleares y hematíes incrementa el riesgo para desarrollar PI. La presencia oral de Candida spp. en pacientes en control con PI es baja y está relacionada con el acúmulo de placa bacteriana y el tipo de rehabilitación protésica.

Con el objetivo de desarrollar una herramienta innovadora, basada en la aplicación de bacteriófagos, para el biocontrol de Campylobacter, se aislaron 304 bacteriófagos a partir de muestras de carne de pollo (280) y excrementos de pollo y cerdo (seis y 18), que, según su tamaño de genoma, se clasificaron dentro de los grupos II (18) y III (286) de campilofagos. Tras un primer análisis de su capacidad lítica contra 19 cepas de Campylobacter se seleccionaron 59 bacteriófagos. Se estudió la diversidad genética de éstos mediante las técnicas de RFLP y RAPD-PCR y se evaluó su espectro lítico frente a 41 cepas de Campylobacter de diferentes especies, fuentes y perfiles de sensibilidad a antibióticos. Se seleccionaron diez bacteriófagos que se enfrentaron a 110 cepas de Campylobacter de diferentes orígenes geográficos (España, Italia y Polonia) y con diferentes perfiles de sensibilidad a antibióticos. Estos bacteriófagos pertenecientes a ambos grupos II y III mostraron una capacidad lítica específica al tiempo que complementaria y fueron capaces de infectar cepas resistentes a antibióticos provenientes de los tres países. Todos se mantuvieron estables y activos a pH de entre 2 y 9 y temperaturas de entre 4 a 42 ° C. Se consideraron, además, aquellos bacteriófagos que tenían períodos de latencia cortos y grandes tamaños de explosión para seleccionar cinco bacteriófagos como los más prometedores para el biocontrol de Campylobacter en toda la cadena de producción de alimentos.

La resistencia a los antimicrobianos es un grave problema de salud pública. Los animales de abasto pueden actuar como reservorio de bacterias resistentes tales como Escherichia coli productor de ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE), cefalosporinasas AmpC y carbapenemasas (CP). En esta Tesis se ha realizado un estudio transversal en rebaños de rumiantes domésticos de la CAV para estimar la prevalencia de E. coli comensal productor de BLEE, AmpC y CP, se ha estudiado su dinámica de transmisión en granjas de bovino lechero y se han utilizado técnicas de secuenciación masiva de genoma completo (WGS) para caracterizar sus genomas y determinantes génicos de resistencia. Los resultados revelan que los rumiantes de la CAV, en particular el ganado bovino lechero, son importantes reservorios de cepas de E. coli productoras de BLEE y multi-resistentes, y se ha constatado que la presencia de E. coli productores de CPs es muy esporádica (un único aislado procedente de terneras de ganado bovino de leche). La secuenciación del genoma de este único aislado permitió la caracterización completa del primer E. coli productor de una carbapenemasa NDM-1 descrito en ganado bovino. Además, gracias a la caracterización por WGS se ha identificado por primera vez en ganado bovino la presencia de Escherichia marmotae, una especie indistinguible de E. coli por técnicas fenotípicas. Con anterioridad esta especie solo había sido descrita en marmotas del Himalaya pero recientemente se ha demostrado su relevancia en clínica humana. Se ha descrito también la compleja epidemiología que subyace a la diseminación de E. coli productor de BLEE en las granjas de bovino lechero.

Aspergillus fumigatus is a filamentous fungus that naturally lives in the soil and is implicated in nitrogen and carbon recycling but is also an opportunistic pathogen. The wide range of environments that can colonized highlights its great adaptability from the beginning of its growth, the germination process. In this PhD thesis, we have studied the differentially expressed genes during two stages of the germination process, swollen and emergence of the germ tube, using a whole genome microarray. Three undescribed overexpressed genes were selected to determine their functions by gene editing approaches using CRISPR-Cas9 technology. We have described the first granulin-like protein in fungi, encoded by Afu6G07200 gene, based on 3D structure similarities. In humans, granulin is related to survival, growth modulation, migration, inflammation, wound repair, and diseases. In fungi, we confirmed its role in proliferation, polarization, cell wall integrity, cytoskeletal organization, and tissue invasion. This work also includes preliminary results showing that the protein encoded by Afu3g08050 gene is the nitrogen metabolite repression transcription factor TamA. Finally, the third selected gene, Afu4g03200, was the most overexpressed gene during germination and encodes a protein involved in maintaining fungal cell structure integrity and the conidiation process.

Arcobacter is a bacterial genus that is wodely distributed in natura. Bacteria belonging to this genus are frequently found in food and water, making them the main sources of transmission to humans. Within the genus, A. buzleri is the most frequently isolated species from human cases, followed by A. cryaerophilus. However, other species have also been with human cases. The prevalence of Arcobacter infections in humans is on the rise.

La materia orgánica de alto peso molecular no es directamente accesible para los procariotas, ya que su tamaño impide el transporte a través de las envolturas celulares. Mediante la actividad enzimática extracelular esta materia es transformada en compuestos de bajo peso molecular, de modo que ya pueden ser incorporadas y utilizadas. Por lo tanto, este proceso microbiano es fundamental en la regulación de la regeneración de los nutrientes inorgánicos y del flujo de carbono a través de la red trófica microbiana. En esta tesis doctoral se ha estudiado la distribución de un conjunto representativo de actividades enzimáticas extracelulares tanto en aguas superficiales costeras como en las zonas epi- y batipelágica de aguas oceánicas; adicionalmente, en el contexto actual de cambio climático, se ha analizado el efecto de la temperatura en las enzimas extracelulares de aguas superficiales oceánicas. El análisis interanual de las cinéticas evidenció la existencia simultánea de un sistema enzimático de alta afinidad y de baja afinidad, que son reflejo de la capacidad de los distintos grupos funcionales de bacterias para hacer frente a las fluctuaciones ambientales que ocurren durante el ciclo estacional. El estudio comparativo de las actividades enzimáticas extracelulares en posibles escenarios de calentamiento de las aguas superficiales oceánicas demostró un enriquecimiento en carbono de la materia orgánica de bajo peso molecular con respecto al nitrógeno y el fósforo, lo que contribuiría a la expansión de las áreas oligotróficas, especialmente en las zonas cercanas a los polos geográficos. Por último, se observó una estrecha conectividad funcional entre las aguas superficiales y profundas del océano tropical y subtropical, reflejo del aporte continuo de agregados orgánicos procedente de la zona epipelágica, tal y como explica la bomba biológica de carbono.

Acinetobacter baumannii multirresistente a los antibióticos es un patógeno que supone una amenaza global, especialmente para los países del Medio Oriente y Norte de África, donde las tasas de resistencia a antibióticos son elevadas. El objetivo de este proyecto de tesis doctoral fue investigar las características genéticas implicadas en la virulencia y resistencia a antibióticos de 36 aislamientos de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos aislados en hospitales de Alejandría, Egipto. Para ello se evaluó la susceptibilidad a antibióticos, se realizaron PCR para la detección de ß-lactamasas y se llevó a cabo la secuenciación global del genoma para establecer relaciones clonales entre los aislamientos mediante MLST, para la búsqueda de genes de resistencia, virulencia y elementos genéticos móviles, y para la localización de los genes de resistencia a antibióticos, además de mediante S1-PFGE. También se llevaron a cabo experimentos para observar aspectos fenotípicos de virulencia como la producción de biofilm y la motilidad. Los resultados de este trabajo mostraron altas tasas de resistencia a antibióticos, con genes de resistencia codificados tanto en cromosoma como en plásmidos. Además, los aislamientos pertenecían a siete clones internacionales diferentes, poniendo en evidencia la necesidad de establecer medidas de control de infecciones más estrictas para evitar la diseminación de clones multirresistentes.

La neumonía adquirida en la comunidad representa la primera causa de muerte por infección a nivel mundial, siendo Streptococcus pneumoniae el agente etiológico identificado con más frecuencia. Aproximadamente entre el 15 y 25% de las neumonías por neumococo presentan una forma bacteriémica. Su significado desde un punto de vista pronóstico es objeto de controversia. Los resultados mostrados en este proyecto de Tesis Doctoral demuestran el papel deletereo que tiene la presencia de una forma bacteriémica en el pronóstico global de estos pacientes. A este respecto, la aparición de una antigenuria para neumococo en el contexto de una bacteriemia por este microorganismo nos va a permitir identificar a un subgrupo de pacientes con un mayor riesgo de muerte durante la fase aguda de la enfermedad. Desde el punto de vista del propio paciente son los factores relacionados con el huesped y en especial la edad los que van a condicionar, en gran parte, el serotipo infectante y el pronóstico de la enfemedad. La presencia de una bacteriemia durante el episodio agudo se va a asociar, entre otros factores, a la presencia de una mayor incidencia de complicaciones cardiacas, del tipo de la fibrilacion auricular, durante el ingreso hospitalario. El momento en el que aparece este tipo de complicación y en especial, su duración y persistencia tras el alta hospitalaria van a identificar a un grupo de pacientes con una mayor riesgo de poder presentar una peor evolución. Además el hallazgo de una bacteriemia durante el ingreso va a tener consecuencias también a largo plazo, asociándose a una mayor probabilidad de morir antes que lo estimado para la población general. Estos resultados, apoyan en su conjunto, la importancia que tiene la prevención de la neumonía neumocócica en general y de las formas bacteriémicas en particular, subrayando el papel fundamental que tiene la vacunación antineumocócica como estrategia de salud pública.

Streptococcus pneumoniae es el agente etiológico identificado con mayor frecuencia entre los pacientes con una neumonía adquirida en la comunidad (NAC) que han requerido un ingreso hospitalario. Actualmente la mayor parte de los diagnósticos bacteriológicos de neumonía neumocócica se realizan precozmente mediante la determinación del antígeno en orina, que es un método sencillo y no invasivo cuyo resultado se obtiene de manera rápida. La neumonía neumocócica se puede presentar como dos entidades bien diferenciadas dependiendo de la presencia o no de una bacteriemia; ésta se objetiva entre un 15 y un 25% de las neumonías causadas por esta bacteria y se ha asociado a un peor pronóstico y a una mayor mortalidad. Además, la NAC neumocócica no se trata de una patología que afecta a todos las personas de la misma manera. La interacción del neumococo con cada huésped específico genera una enfermedad distinta con un pronóstico a corto y a largo plazo totalmente diferente. Por ello, los estudios que forman esta Tesis Doctoral pertenecen a una misma línea de investigación llevada a cabo con el objetivo de tratar de esclarecer las diferentes formas de presentación de la neumonía neumocócica adquirida en la comunidad en el huésped sin inmunodeficiencia, su pronóstico a corto y a largo plazo, así como las diferencias con otras neumonías causadas por distintos microorganismos también muy prevalentes. Los resultados obtenidos y publicados en revistas de amplia difusión internacional aportan una información relevante para el mejor conocimiento y manejo de esta entidad.