Resumen tesis doctoralGastro resistant microparticles as an oral cholera vaccine approachMicropartículas gastrorresistentes como estrategia para una vacuna oral frente al cóleraA pesar de que la enfermedad del cólera y su agente causante, el Vibrio cholerae, son conocidos desde el siglo XIX, el cólera sigue siendo una enfermedad con una alta incidencia hoy en día, sobre todo en los lugares donde las criterios mínimos de higiene no se cumplen. En este contexto, la prevención de la enfermedad es un punto clave. Dentro de las estrategias de prevención y control de la enfermedad, se sitúan la implementación del saneamiento así como la vacunación. Desde 1999 La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda el uso de la vacuna oral frente al cólera en ciertas regiones endémicas o situaciones de emergencias. Tras el re-análisis del ensayo clínico realizado en Bangladesh con una vacuna oral del cólera se observó que el hecho de que una parte de la población estuviese vacunada proporcionaba una protección comunitaria. Es por ello, que el desarrollo de una vacuna eficaz y segura frente al cólera supondría un paso más en el control de los brotes de la enfermedad. En la actualidad existen dos vacunas autorizadas para su comercialización. No obstante, no cumplen todos los requisitos que la OMS cree que debería tener la vacuna oral ideal para cólera que son las siguientes:- Poder administrarse en una sola dosis y sin agua o tampón.- No necesitar cadena de frío- Ser apta para niños menores de 2 años- Conferir protección a largo plazoEn el transcurso de las últimas décadas se ha profundizado en el desarrollo de micropartículas como vehículos que aportan longevidad y potencia añadida a los epitopos, dando lugar a un nuevo arsenal para la elaboración de vacunas novedosas. Teniendo esto en mente los objetivos de esta tesis son los que se describen a continuación:1. Optimizar una técnica de secado por atomización o ¿Spray drying¿ con el fin de obtener micropartículas gastrorresistentes cargadas con Vibrio cholerae C7258 inactivado térmicamente. Más concretamente, se busca estudiar la influencia de la temperatura de entrada a la cámara en las micropartículas obtenidas usando diferentes polímeros metacrílicos como son el Eudragit® FS30D y Eudragit® L30 D-55. Asimismo, se persigue establecer la capacidad de las micropartículas de Eudragit® para inducir respuesta inmune en ratas tras su administración oral.2. Estudiar y caracterizar las micropartículas de Eudragit® L30 D-55 con o sin agentes mucoadhesivos, tales como el alginato o el Carbomero 934, Carbopol®. Llevar a cabo un estudio de estabilidad en condiciones de largo plazo, intermedias y aceleradas para analizar el comportamiento térmico de las partículas. La evaluación de la respuesta en ratas tras la administración de diferentes regímenes de administración de las micropartículas de Eudragit® L30 D-55 con y sin mucoadhesivos.3. Examinar la toxicidad tras dosis repetidas de las micropartículas de Eudragit® L30 D-55 con y sin alginato. La toxicidad se estudiará en base a la evolución del peso, la ingesta de agua y alimentos así como a los parámetros hematológicos y las histologías y peso de los órganos tras la necropsia. Se controlará la respuesta inmunológica desarrollada a través de la detección de títulos vibriocidas.4. Aplicar la técnica de ¿Spray drying¿ para elaborar y caracterizar micropartículas de acetatoftalato de celulosa, Aquacoat® CPD. Asimismo, analizar la respuesta inmune in vivo mediante el análisis de la producción y distribución de las diferentes inmunoglobulinas además de la detección de los niveles de interferón gamma.En la primera parte de este trabajo se emplearon los polímeros Eudragit® FS30D y Eudragit® L30 D-55 con el fin de obtener micropartículas mediante ¿Spray drying¿ a diferentes temperaturas de entrada, 60ºC, 80ºC y 100ºC. Estas partículas se caracterizaron en términos de la morfología de la superficie por microscopia, de tamaño de partícula, eficiencia de encapsulación, antigenicidad y perfil de liberación. Se pudo observar que las partículas preparadas a 60 y 80ºC presentaron los mejores resultados en términos de antigenicidad y eficacia de encapsulación. Las micropartículas a partir de Eudragit® FS30D mostraron resultados siempre inferiores a las de Eudragit® L30 D-55, sobre todo en lo que a antigenicidad y perfil de liberación se refiere. En los consiguientes experimentos con animales, se pudo observar, a pesar de que las diferencias no resultaron estadísticamente significativas, que las micropartículas a base de Eudragit® L30 D-55 fueron capaces de estimular una respuesta inmune más intensa. En el siguiente estudio in vivo realizado se compararon diferentes dosis de las micropartículas de Eudragit® L30 D-55 frente a las mismas dosis de la bacteria libre. De esta manera se pudo ver que las dosis 70 y 35 mg de micropartículas obtuvieron la respuesta inmune más intensa incluso que la misma dosis de Vibrio cholerae en suspensión.En el segundo trabajo experimental se examinaron micropartículas elaboradas con Eudragit® L30 D-55 a las que se les añadieron alginato o carbomero, Carbopol® como agente mucoadhesivo. Además también se prepararon micropartículas sin ninguno de estos agentes. Todas estas formulaciones presentaron un tamaño entre 7 y 9 µm, una alta eficacia de encapsulación y un perfil de liberación dependiente del pH. En el caso de las micropartículas que contenían Carbopol® la antigenicidad se vio comprometida, cayendo de los valores usuales hasta un 25%. A continuación se procedió a estudiar la estabilidad de las micropartículas sin y con alginato. Para ello las muestras se dispusieron en cámaras climáticas a 25ºC y 60% de humedad relativa (HR) durante12meses, 30ºC y 65% HR y 40ºC y 75% HR durante 6 meses siguiendo la guía ICH Q1 A (R2). Tras esta etapa de almacenamiento las partículas continuaron presentando propiedades gastrorresistentes y su antigenicidad se mantuvo dentro del criterio propuesto por la FDA (67% de las muestras debía mantenerse dentro del 15% de cambio y el 33% podría estar fuera del 15%). Asimismo la morfología no sufrió cambios que pudieran sugerir una degradación observable como podría ser la erosión o el hinchamiento. El tamaño de partículas presentó cambios estadísticamente significativos, no obstante se mantuvieron dentro del 10% respecto al inicio del estudio. Sólo un valor de micropartículas con alginato se desvío del 10%, pero no supero el 25%. En la tercera fase de este trabajo se realizaron las pruebas en ratas. En un primer experimento las tres formulaciones desarrolladas fueros administradas siguiendo una posología de dos administraciones los días 0 y 14. Se pudo observar el día 21, que las micropartículas con Carbopol® produjeron una respuesta inmune inferior a la del Vibrio cholerae en suspensión. Esto junto los resultados in vitro obtenidos nos llevo a descartar las partículas con Carbopol® para los siguientes estudios. En el siguiente experimento se analizó la influencia del número de dosis. Para ello se administraron una o dos dosis de micropartículas con y sin alginato así como Vibrio cholerae. Se pudo observar que la administración de dos dosis de micropartículas con alginato producía una respuesta estadísticamente superior a la del Vibrio cholerae y las micropartículas sin mucoadhesivos. Finalmente, se administraron diferentes dosis-60, 30, 15, 7.5 mg- de micropartículas con alginato y se constato que las dosis de 60 y 30 mg daban lugar a un mayor nivel de títulos vibriocidas. Tras estos esperanzadores resultados se procedió al estudio de la toxicidad de las micropartículas. Para ello, se administraron 3 dosis de micropartículas con y sin alginato y se estudió la evolución del peso, apetito y sed de las ratas. Además los parámetros hematológicos, las histologías tras las necropsias y los títulos vibriocidas fueron examinados. De este estudio se pudo inferir que las micropartículas con y sin alginato eran efectivas y seguras, ya que ninguno de los parámetros estudiados presentó tendencias negativas por el tratamiento. En el estudio experimental que cierra esta tesis se investigó la aplicación de otro polímero, el acetatoftalato de de celulosa, para el desarrollo de micropartículas como candidato vacunal frente al cólera. Así, se siguieron las pautas anteriormente marcadas y se empleó la técnica de secado por atomización para su elaboración. Esta vez, se estudiaron dos temperaturas diferentes de entrada a la cámara, 60 y 80ºC. Estas partículas se caracterizaron una vez más mediante microscopía, tamaño, eficiencia de encapsulación, antigenicidad y perfil de liberación. Las partículas obtenidas presentaron un tamaño de 6 µm con una alta eficiencia de encapsulación entre 90 y 95%. Además la antigenicidad presentó unos valores entre 86 y 97%, con lo que la integridad del antígeno tras su encapsulación estaba confirmada. En el estudio de gastrorresistencia se pudo observar que las micropartículas cumplían con el criterio establecido por la Farmacopea al liberarse menos del 10% durante la incubación en la etapa ácida y liberando su contenido en la etapa de pH neutro. Con el objetivo de ver el efecto in vivo de las formulaciones desarrolladas se prosiguió con la experimentación en ratas. Para esta etapa se seleccionaron las micropartículas elaboradas a 80ºC con y sin alginato. Se estableció un protocolo de dos administraciones de 60 o 30 mg de micropartículas con y sin alginato los días 0 y 14. Con las muestras plasmáticas se analizaron las poblaciones de IgG, IgG2b, IgG2c, IgM e interferón-¿. Para la IgG total se vio que la dosis de 60 mg produjo una respuesta inmune más débil que la dosis de 30 mg con alginato y el Vibrio cholerae en ciertas semanas. En el caso de las IgG2b no se detectó diferencia alguna entre los grupos. Para las IgG2c, en cambio, las dosis de 60 mg presentaron unos niveles inferiores a los del Vibrio cholerae. Cuando se procedió a la cuantificación de los niveles de IgM, se observó que por un lado las formulaciones sin alginato, tanto a 30 como a 60 mg, presentaron niveles más bajo de inmunoglobulinas que el Vibrio cholerae y las partículas con alginato en dosis de 30 mg. Sin embrago, hacia el final del estudio fueron las micropartículas de 60 mg con alginato las que demostraron ser menos inmunogénicas que la dosis inferior de Vibrio cholerae. Al analizar la producción de interferón gamma no se detecto ninguna diferencia entre grupos. Tras analizar los resultados del in vivo se pudo apreciar que las micropartículas de Aquacoat® CPD cuando se combinan con alginato son capaces de producir una respuesta inmune en términos de IgG total, IgG2b, IgG2c, IgM e INF-¿ similares a las producidas por el Vibrio cholerae. Las micropartículas elaboradas tienen la ventaja de estar en forma de polvo, lo que facilita su transporte y además brinda la posibilidad de desarrollar otras formas farmacéutica tales como comprimidos o granulados. Teniendo en cuenta los resultados resumidos previamente, esta tesis llevo a las siguientes conclusiones:-La técnica de ¿Spray dyring¿ resultó adecuada para el desarrollo de micropartículas a partir de los polímero seleccionados. Se obtuvieron micropartículas de 3 a 9 µm con una alta eficacia de encapsulación. Las partículas presentaron propiedades gastro resistentes en todos los casos llegando a liberar el 30% tras 24 horas. Las formulaciones mantuvieron la antigenicidad de la bacteria (>75%), salvo cuando se le añadía Carbopol®.-Tras la administración oral de las micropartículas se pudo detectar que cuando el polímero utilizado era el Eudragit® L30 D-55, los animales presentaron valores más elevados de títulos vibriocidas que con Eudragit® FS30D. -Las micropartículas a base de Eudragit® L30 D-55 con alginato presentaron mayor inmunogenicidad que las partículas sin alginato o con Carbopol®.-El estudio de estabilidad 25ºC y 60% de humedad relativa (HR) durante12meses, 30ºC y 65% HR y 40ºC y 75% HR durante 6 meses (ICH Q1 A (R2) se pudo ver que la antigenicidad se mantuvo dentro de los valores de aceptación. Asimismo, las micropartículas con alginato presentaron un perfil de liberación más adecuado.-Tras el estudio de toxicidad de dosis repetidas se constato que las micropartículas de Eudragit® L30 D-55 con o sin alginato son seguras.-Basándonos en los resultados de los experimentos in vivo, de estabilidad y toxicidad, el Vibrio cholerae microencapsulado en Eudragit® L30 D-55, y especialmente cuando se añade alginato, da lugar a una vacuna segura, efectiva y que no precisa cadena de frío.-Los resultados del estudio in vitro de las micropartículas de Aquacoat® CPD con y sin alginato mostraron que las partículas obtenidas presentaban un tamaño entorno a 6 µm, con una eficacia de encapsulación de 89-95% y una alta antigenicidad. El perfil de liberación presentó propiedades gastrorresistentes liberando el 30% de la bacteria a las 24 horas. -Los resultados del estudio in vivo de las micropartículas de Aquacoat® CPD revelaron que las micropartículas con y sin alginato y en dosis de 30 mg son capaces de inducir una respuesta inmune similar al Vibrio cholerae.